Использование микологических и энтомологических методов при судебно-медицинском установлении давности смерти и места захоронения трупа : Новая медицинская технология

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКИЙ ЦЕНТР СУДЕБНО-МЕДИЦИНСКОЙ ЭКСПЕРТИЗЫ

(125284, г. Москва, ул. Поликарпова, д.12/13)

 

 

 

 

Использование микологических и энтомологических методов при судебно-медицинском установлении давности смерти и места захоронения трупа

Новая медицинская технология.

 

 

 

 

МОСКВА

2007

 

 

Аннотация

Предлагаемая медицинская технология предназначена для судебно-медицинских экспертов. Она позволяет по результатам комплексного миколого-энтомологического  исследования захоронения  трупа, включающего в себя анализ состава микроскопических грибов и насекомых, заселяющих труп при развитии поздних трупных изменений, сделать заключение о давности наступления смерти и возможном маршруте его перемещения с целью сокрытия совершенного преступления.

Предлагаемы комплексный миколого-энтомологический метод является новым и не  имеет отечественных и зарубежных аналогов. Технология предназначена для использования в Бюро судебно-медицинской экспертизы Российской федерации.

Медицинская технология подготовлена сотрудниками танатологического отдела Российского центра судебно-медицинской экспертизы Росздрава: заведующим отделом д.м.н. Д.В. Богомоловым, старшими научными сотрудниками  к.б.н. Аманмурадовым А.Х.,  к.м.н. И.Н.Богомоловой,   к.м.н. Барановой М.Я., к.б. н. Пирязевой Е.А., к.б.н. Малиновской Л.С. , мл.н.с. Таргашиным А.В., аспирантом А.П. Бобровым

Рецензенты:

• Заведующий кафедрой судебной медицины РУДН, профессор Д.В. Сундуков
• Заведующая кафедрой судебной медицины Чувашского государственного университета им. И.Н. Ульянова, профессор А.З. Павлова
• Главный судебно-медицинский эксперт Бюро главной судебно-медицинской экспертизы ФМБА РФ  А.Г. Глазунов
• Заведующий кафедрой судебной медицины с курсом правоведения Омской государственной медицинской академии, профессор  В.П.Конев

 

 

ВВЕДЕНИЕ

Данная технология предлагается впервые. В отличие от предыдущих подходов она позволяет использовать комплекс методов судебно-медицинской микологии  и энтомологии для установления давности наступления смерти и маршрута перемещения трупа. Установлена закономерность изменения состава микобиоты и энтомофауны останков и места захоронения со временем, учет которых дает необходимые сведения о давности смерти и перемещениях трупа. 

Практические учреждения, в которых рекомендуется осуществить реализацию данной новой медицинской технологии, – Бюро судебно-медицинской экспертизы Российской Федерации.

 

ПОКАЗАНИЯ К ПРИМЕНЕНИЮ МЕТОДА

Показания к применению данной технологии.

1. Судебно-медицинское исследование трупа с поздними трупными явлениями при необходимости установления давности наступления смерти и маршрута перемещения трупа.
2. Судебно-медицинское исследование расчлененного и фрагментированного трупа с поздними трупными явлениями при необходимости установления давности наступления смерти и маршрута перемещения трупа и его частей.

Противопоказания к применению технологии.

Абсолютные противопоказания.

1. Судебно-медицинское исследование трупов без признаков поздних изменений..
2. Судебно-медицинское исследование трупов с явлениями взрывной травмы и значительного обгорания.

Относительное противопоказание.

Смерть в условиях очевидности, не связанная c необходимостью установления её давности

 

МАТЕРИАЛЬНО-ТЕХНИЧЕСКОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ МЕТОДА

Предлагаемая медицинская технология не требует специальных технических средств. Достаточно штатного оснащения Бюро судебно-медицинской экспертизы, микологических и энтомологических лабораторий. Для проведения испытаний применяют стандартное оборудование и реактивы танатологических отделений и судебно-гистологических лабораторий Бюро судебно-медицинской экспертизы:

1. Стандартное оборудование для вскрытия трупа.
2. Стандартные аппаратура, материалы, реактивы, используемые для проведения микологического анализа (стандартное оборудование микологической лаборатории).
3. Стандартное оборудование энтомологической  лаборатории (ламинары, термостаты, посуды для выращивания и определения насекомых, питательные среды, определители).

 

ОПИСАНИЕ МЕТОДА

В процессе осмотра места происшествия, а также судебно-медицинского исследования трупов с поздними трупными изменениями, помимо стандартных действий проводятся следующие специальные мероприятия:

1.     При обнаружении трупа с явлениями поздних трупных изменений, в отношении которого возникли вопросы о давности смерти и маршруте его перемещения, в процессе его осмотра изымают фрагменты покровов и внутренних органов, образцы почвы и представителей энтомофауны, используя стерильную посуду (скальпель, ножницы, пинцет, пробирки с притертой крышкой и баночки-морилки с медицинским  эфиром). Все операции, связанные с отбором материалов, должны проводится в стерильных условиях - около пламени спиртовки.

2.     При вскрытии трупа в танатологическом отделении производится повторный забор образцов, т.к. многие представители энтомофауны и микобиоты проникают глубоко в труп и там гнездятся.

3.     Проводится микологический анализ биоматериала и почвы с места обнаружения трупа.

3.1. Метод выявления микроскопических грибов из патматериала.

3.1.1. Микроскопическое исследование.

  В лаборатории при обнаружении поражений плеснеобразующими микромицетами, локализованными на поверхности материала необходимо  к микроскопическое исследование. Частицы мицелия помещают на предметное стекло в каплю фиксирующей жидкости, состоящей из равных частей дистиллированной воды, этилового спирта и глицерина, покрывают покровным стеклом и рассматривают с помощью малого (х8, х10) и среднего (х40) увеличений микроскопа.

3.1.2. Выделение грибов из материала.

Выделение грибов из биологического материала, предварительно измельченного стерильными ножницами на небольшие кусочки (0,3-0,5 см) проводят путем прямого посева (раскладывания) на поверхность питательной среды в чашки Петри. В случае отсутствия возможности проведения микологического анализа материала непосредственно после его забора, материал необходимо хранить в холодильнике при температуре 0-3˚ в течение 1-1,5 месяца.

3.2. Выделения микроскопических грибов из почвы.

Метод основан на следующих операциях: посев взвесей, приготовленных путем последовательных десятикратных разведений почвы, на питательную среду в чашки Петри; инкубация грибов; подсчет выросших колоний грибов (предварительно идентифицированных до рода) для определения общего (суммарного) числа грибов (ОЧГ), выражаемого количеством колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 г исследуемого материала.

3.2.1. Методы выделения грибов из почвы.

Для приготовления последовательных разведений почвы предварительно готовят 0,1%–ный раствор поверхностно–активного вещества в дистиллированной или питьевой воде (Твин-80, ОП-10, ОП-7). Полученный раствор, являющийся разбавителем для получения взвесей почвы, разливают по 100 см³ в колбы вместимостью 500 см³ и по 9 см³ в пробирки, после чего стерилизуют. Из различных точек анализируемой пробы (не менее 5-и) стерильным шпателем в стерильную колбу емкостью 50см³ или 100см³ отбирают навеску 10г, при этом стараясь соблюдать минимальный контакт почвы с воздухом помещения для предотвращения дополнительной его контаминации. Навеску помещают в колбу вместимостью 500 см³, содержащую 100 см³ стерильного разбавителя, получая при этом первичную взвесь 1 (разведение 10–1) и проводят дезинтеграцию пробы встряхиванием колбы с содержимым в течение 15-20 мин. на шюттель-аппарате. Затем из                        взвеси 1 готовят последующие разведения, используя стерильные разбавители, разлитые по 9 см³ в пробирки. Для этого 1см^з взвеси 1 приливают в пробирки с 9см³ разбавителя и получают взвесь 2 (разведение 10-2). Из полученной взвеси 2 готовят таким же образом взвесь 3 (разведение 10-3), 4 (10-4), 5 (10-5). Перед взятием очередной порции взвеси как для получения последующего разведения, так и для посева, необходимо тщательно перемешивать взвесь пипеткой, а также промывать пипетку во взвеси не менее 5 раз. Пипетки (типа1), используемые для приготовления взвесей, вымерены на слив жидкости от верхней нулевой отметки до любой другой отметки; нижняя отметка соответствует номинальной вместимости, в которую объём сливного кончика не включен. Это позволяет отрезать кончик пипетки для увеличения диаметра выпускного отверстия до 3мм и дает возможность легко набирать в пипетку исследуемый материал, при этом точность измерения объема не нарушается. Для посева 1 пробы почвы используют 10 чашек Петри с агаром. В каждую из 10 чашек вносят по 1см^з тщательно перемешанной взвеси, не давая ей отстояться. В первые 2 чашки вносят взвесь 5 (разведение 10-5), в две другие - взвесь 4 (разведение 10-4), в две следующие - взвесь 3 (разведение 10-3),в 2 - взвесь 2 (разведение 10-2), в 2-е оставшиеся - взвесь 1 (разведение 10-1). Взвесь равномерно распределяют по всей поверхности питательной среды, осторожно наклоняя чашку в разные стороны, стараясь, чтобы она не попала на боковые стенки чашки.

3.2.2. Количественный учет выросших колоний грибов.

После окончания инкубации, через 7-10 суток проводят учет выросших колоний грибов - плеснеобразующих, дрожжей и  дрожжеподобных. Учет проводят в посевах тех разведений, где число колоний на каждой из двух чашек не превышает 150.

3.3. Инкубация грибов.

Чашки с посевами как биоматериала, так и почвы помещают в термостат, не переворачивая их крышкой вниз. Инкубацию проводят при температуре 22-25°С в течение 7-10 суток. Рост и спороношение большинства плеснеобразующих грибов становится заметным уже через 2-3 суток, дрожжей и дрожжеподобных грибов - через 2 суток.

3.3.1. Для предупреждения загрязнения посевов применяемая посуда (чашки Петри, пипетки и др.) и инструменты должны быть стерильными. Стерилизацию стеклянных чашек Петри, пипеток, завернутых в бумагу, проводят в сушильном шкафу при температуре 140-160°С в течение 2-х часов. Все процессы, связанные с разливкой питательных сред в чашки Петри, посевом биоматериала, приготовлением взвесей почвы путем последовательных разведений ее и посевом их на питательную среду, должны проводиться в стерильных условиях - около пламени горелки или спиртовки в специальном боксе. Перед каждой серией посевов проводят контроль зараженности воздуха в боксе спорами грибов седиментационным методом, для чего 1-2 чашки со средой оставляют открытыми в течение 3-х минут.

3.3.2. Стерилизацию бокса, рабочего помещения проводят парами формальдегида с последующей нейтрализацией водным аммиаком. На 1м^З обьема помещения расходуют 45см^З 40%-ного формальдегида, к которому добавляют 20смз воды и 30г марганцовокислого калия. Дезинфекцию проводят в течение 2 ч, после чего для нейтрализации паров формалина применяют водный аммиак из расчета 50% от объема затраченного формальдегида. В целях безопасности целесообразно дезинфекцию провести в конце рабочего дня, утром следующего дня - нейтрализовать пары формалина. Термостат, холодильник можно дезинфицировать, поместив 2-3 чашки Петри без крышек с формальдегидом на 3 ч, не добавляя марганцовокислый калий, или обработкой их внутренних поверхностей спиртом. Обеззараживания воздуха бокса, рабочего помещения можно провести также используя ультрафиолетовые облучатели (типа УГДЗ) с источником излучения - лампы ДРТ 1000 с экспозицией 2ч. Необходимо соблюдать осторожность при использовании указанных методов дезинфекции помещения и бокса - приступать к работе следует не ранее следующего дня.

3.4. Идентификация грибов.

Родовую (и при возможности видовую) принадлежность грибов устанавливают в первичной культуре. Чаще гриб предварительно выделяют в чистую культуру, для чего применяют два метода: непосредственного пересева и метод разделения.

3.4.1. Метод непосредственного пересева материала применяют в том случае, если в первичном посеве выросли изолированные колонии. Пересевают маленький участок мицелия или часть колонии, помещая их на поверхность одной из вышеназванных питательных сред. При этом следует избегать комкания, скручивания и деформации взятого участка мицелия. При наличии обильного спороношения (например у Aspergillus или Penicillium) иглой лишь слегка касаются спороносящей поверхности колонии и переносят минимальное количество спор. При использовании пробирок взятый инокулюм помещают в нижнюю треть косяка в одном месте поверхности среды. слегка касаясь ее. При посеве в чашку инокулюм помещают 3-5 точках. В последнем случае чашки во время инокуляции, а также при последующей инкубации располагают кверху дном для предотвращения рассеивания спор по всей агаровой пластинке.

3.4.2. Метод разделения применяют в тех случаях, если колонии загрязнены другими грибами или бактериями, что устанавливают обычно визуально. С этой целью готовят 3-4 последовательных разведения  взвеси спор гриба в стерильном 0,1%-ном растворе твина-80 (либо ОП-7, ОП-10) в воде и высевают из 1-2 последних разведений по 1 мл на поверхность агара в чашки Петри, наклоняя чашку в разные стороны. При наличии обильного спороношения разделения проводят с помощью посева - коснувшись стерильной, влажной иглой ( или микологическим крючком ) ограниченного участка спороносящей поверхности проводят его штрихом по поверхности агаровой пластинки в чашке Петри. Штриховой посев особенно эффективен, если контаминат - бактерии.

3.4.3. Родовая и видовая идентификация грибов.

При микроскопическом изучении признаков грибов сначала определяют их культуральные свойства, рассматривая колонии на месте их роста, при этом учитывают цвет, форму, консистенцию колоний, характер роста, форму растущего края, наличие или отсутствие склероциев, пигмента, степень развития воздушного мицелия.

3.4.4. Для микроскопического исследования готовят препарат раздавленной капли, учитывая строение мицелия и органов спороношения. Для этого частицы мицелия, взятые микологическим крючком (из пробирок) или препаровальной иглой (из чашек), из равных частей колонии как из старых (ближе к центру), так и из молодых (у края), помещают на предметное стекло в небольшую каплю фиксирующей жидкости для препаратов, при этом используют вторую иглу, с помощью которой осторожно снимают и расправляют материал. Покрывают препарат покровным стеклом и слегка надавливают на него, стараясь не загрязнить сверху; в случае, если по краям покровного стекла появляется избыток жидкости, его следует убрать с помощью кусочка фильтровальной бумаги.

3.4.5. Фиксирующей жидкостью, наиболее пригодной для приготовления препаратов грибов Aspergillus, Penicillium, Paecilomyces, является лактофенол Аммана в состав которого входят: дистиллированная вода 1 часть, молочная кислота 1 часть, глицерин 2 части, фенол 1 часть. Прежде чем поместить изучаемый материал в указанную жидкость его следует кратковременно (до 30 секунд) обработать 70° этиловым спиртом для смачивания спор и удаления их избытка.

Для изучения грибов из рода Fusarium, Byssochlamys, мукоровых грибов используют жидкость, состоящую из равных частей дистиллированной воды, этилового спирта и глицерина, при этом исследуемый материал спиртом не обрабатывают.

3.4.6. Микроскопию препарата проводят с помощью малого (обьектив х8, х10), а затем среднего (обьектив х40) увеличения микроскопа. Родовую и видовую принадлежность грибов устанавливают, пользуясь специальными определителями с микологическими ключами.

3.5. Приготовление питательных сред.

Оптимальными средами для выделения грибов являются сусловый агар, агар Чапека - Докса, можно использовать также и картофельно - глюкозный агар. Для сокращения скорости роста грибов и предотвращения нарастания колоний друг на друга и, следовательно, получения изолированных колоний в питательные среды добавляют медицинскую консервированную желчь, а также антибиотики - для подавления роста бактерий.

3.5.1. Приготовления суслового агара с желчью.

Неохмеленное пивное сусло, содержащее 12-14% сахаров, фильтруют через слой ваты или 3-4 слоя марли, разбавляют дистиллированной водой с таким расчетам, чтобы количество сахаров составило 6-7% по ареометру Баллинга, затем добавляют 2-3% агар-агара и 100 мл медицинской консервированной желчи на 1000 мл среды; устанавливают рН среды в пределах 5-5,5. Разливают среду по колбам и стерилизуют в автоклаве при температуре 110-112°С (давлении 0,5 Мба) в течение 20 минут.

3.5.2. Приготовление агара Чапека-Докса с желчью.

В состав агара Чапека-Докса с желчью входят следующие компоненты:

• - сахароза - 30,0 г;

• - натрий азотнокислый - 2,0г;

• - калий фосфорнокислый однозамещенный - 1,0г;

• - магний сернокислый - 0,5г;

• - калий хлористый - 0,5г;

• - железо сернокислое      - 0,01г;

• - желчь медицинская - 100мл;

• - вода дистиллированная - 1000мл;

• - агар-агар - 20,0 - 30,0г;

• - рН среды: 5-5,5.

Для приготовления среды берут 20-30 г агар-агара, заливают его 1000 мл дистиллированной воды и вымачивают 2 часа при комнатной температуре. Воду сливают и измеряют ее обьем для определения количества воды, впитавшейся в агар-агар, который затем промывают 2-3 раза дистиллированной водой. Отвешивают остальные компоненты среды, кроме желчи, растворяют в таком обьеме дистиллированной воды, который составила слитая, при вымачивании агар-агар, после чего варят среду в автоклаве текучим паром в течение 1 часа. Полученную среду фильтруют, добавляют желчь, разливают по колбам и стерилизуют в автоклаве при температуре 110-112°С (давление 0,5 МБа) в течение 20 минут.

3.5.3. Приготовление картофельно-глюкозного агара.

Для приготовления картофельно-глюкозного агара используют 200,0г картофеля, 15,0г глюкозы, 20,0г агар-агара на 1000 мл дистиллированной воды. Очищенный и нарезанный кубиками картофель (не молодой) кипятят в течение 10 минут. Отвар фильтруют, через тонкий слой ваты или 2-3 слоя марли. В отваре расплавляют агар-агар, добавляют глюкозу. Вместо глюкозы можно использовать сахарозу, в таком случае будет приготовлена картофельно-сахарозный агар. Полученную среду разливают по колбам, затем стерилизуют при температуре 121°С (давление 1 МБа), рН не устанавливают.

Перед посевом материала питательный агар расплавляют в водяной бане, затем после охлаждения его до 45-50°С для подавления сопутствующей бактериальной флоры добавляют антибиотики - 50 000 еД пенициллина 100 000 еД стрептомицина на 1000 мл среды Пенициллин и стрептомицин разводят в стерильной дистиллированной воде. После этого агар разливают в стерильные чашки Петри и дают остыть на ровной горизонтальной поверхности. Слой агара должен быть не менее 0,5 см.

4.Параллельно с определением видов грибов производится определение насекомых с использованием доступных определителей и составляется таблица, отражающая население трупа и могилы окрест него. Для этого заморенных насекомых помещают в лоток и изучают с помощью сильной лупы, описывая в принятом порядке основные их признаки с целью установления их систематической принадлежности.

5. По результатом микологического и энтомологического анализов составляется таблица, отражающая население трупа и могилы окрест него.

6. Согласно диагностическим таблицам развития насекомых и грибов с ретроспективным  учетом температуры и влажности воздуха, создается модель развития энтомофауны и микобиоты трупа, которая сравнивается с биотопом захоронения.

Диагностическое значение обнаружения тех или иных представителей микобиоты и энтомофауны при гнилостных изменениях трупа при оптимуме условий для развития энтомофауны и микобиоты (температура + 20-25° С, влажность 70-90%) выглядит в наших исследованиях, следующим образом.

Микобиота и энтомофауна трупных тканей в различные сроки после захоронения при развитии их гниения.

Давность захоронения	Микобиота трупных тканей	Энтомофауна
0-2 недели	Penicillium sp.	Кладки яиц Diptera, антропофильные насекомые – вши, блохи.
2-4 недели	Mucor sp. Geotrichum sp. Fusarium sрp.   Aspergillus fumigatus	Личиночные формы Diptera, Имагинальные формы Сoeloptera (Стафилины и Карапузики).
4-6 недель	Geotrichum sp. Penicillium spp.                                            Fusarium sрp.	Пупарии Diptera, личиночные формы новых генераций.Личиночные и имангинальные формы Сoelеoptera (Стафилины и Карапузики).
6-8 недель	Geotrichum sp. Penicillium spp. Fusarium spр. Trichoderma sp.	То же.
8-10 недель	Geotrichum sp. Aspergillus flavus Fusarium sрp. Trichoderma ¾ sp. Aspergillus fumigatus Absidia ¾ sp. Trichoderma sp.	Исчезновение личиночных форм Diptera, в остальном то же.
10 ¾ 14 недель	Geotrichum sp. Aspergillus flavus                                                                         Fusarium ¾ sрp. Aspergillus flavus               Trichoderma sp.	Появление новых видов Сoelеoptera (Кожееды). Уменьшение обилия Стафилинов и Карапузиков. Пупарии Diptera
Более 2-х месяцев	Geotrichum sp. Aspergillus flavus  Fusarium sрp. Trichoderma sp.	Преимущественно Коджееды, редкие представители Стафилинов и Карапузиков. Пупарии Diptera

 

7. При обнаружении омыленного трупа (т.е. трупа в состоянии жировоска) его энтомофауна и микобиота отличаются следующими особенностями. Отмечается резкое изменение состава микобиоты при омылении трупа.

• · Сохранение лишь одного рода грибов Chrysosporium sp в финале формирования жировоска.
• · Исключительная роль муравьев в его формировании, которая сказывается также и на общем профиле энтомофауны (вынужденная бедность двукрылых, недоразвитие фауны жуков и их личинок),
• · присутствие имагинальных форм наездников ихневмонид (Ihneumonidae), а также ос (Vespidae)).

8. Мумифицированный труп может быть стерилен в отношении грибов и насекомых.

9. Также производится микологический и энтомологический анализ почвы из места захоронения и его окрестностей. Эти данные сопоставляются с населением собственно трупа.

10. Отмечаются несоответствия полученных по различным параметрам сроков ДНС и исходя из средних значений выводится среднее время захоронения с указанием на особенности, которые могут иметь отношение к посмертному перемещению трупа. 

11. При очевидном несоответствии состава микобиоты и энтомофауны трупа и места захоронения можно говорить о посмертном перемещении трупа и с помощью анализа обитателей по предполагаемому маршруту перемещения уточнять его основные пункты.

 

ЭФФЕКТИВНОСТЬ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МЕТОДА

В ходе разработки метода использованы результаты вскрытия, качественного, полуколичественного и количественного судебно-микологического и судебно-энтомологического исследования 40  трупов лиц с поздними трупными изменениями и 6-и экспериментальных объектов на протяжении 3-х теплых сезонов года. А также учтены данные анализа образцов почвы из 5 климатических зон РФ и сопредельных государств на предмет обнаружения особенностей состава насекомых и микроскопических грибов.

До разработки данного метода не было возможности научно обосновать возможность применения комплексного судебно-энтомологического и судебно-микологического исследований для установления давности наступления смерти и маршрута перемещения трупа была не установлена.   Таким образом, метод не имеет аналогов.

Для испытания разработанного метода использовано 11 наблюдений из экспертной практики, где ставились вопросы о давности смерти и месте первичного захоронения. Во всех наблюдениях применение метода дало возможность научно обоснованно ответить на эти вопросы. Эти данные подтверждают практическую значимость разработанного метода.

Достоинства метода состоят также в том, что он, являясь комплексным,  не требует ни применения дорогостоящей техники и расходных материалов, ни длительного обучения экспертов и больших затрат их рабочего времени.