Спектрофотометрический метод определения алкоголя в крови живых лиц

Сложность экспертизы алкогольного опьянения заключается в необходимости установить связь между количеством принятого алкоголя, вызвавшем реактивное состояние, и его наличием в крови в различное время абсорбции и элиминации. Экспертизу затрудняет также и отсутствие надежных, объективных, быстро выполнимых методов количественного определения алкоголя в крови.

В настоящее время для этого определения существует много методов: химических, — основанных на окислении алкоголя, на образовании определенных производных алкоголя; каталитических и физических, — основанных на измерении объема алкоголя, коэффициента преломления и т. д. Эти методы наряду с высокой точностью и чувствительностью имеют ряд следующих недостатков: длительность анализа, отсутствие объективной записи результатов анализа, потеря специфичности в определенных условиях, что снижает их роль в практике судебной экспертизы.

В ряде работ¹ авторы, стараясь уменьшить значение этих недостатков, предлагают использовать спектрофотометрирование в качестве конечного этапа количественных определений этилового спирта в одной из модификаций метода Видмарка.

В 1959 г. в спектральной лаборатории физико-технического отдела Научно-исследовательского института судебной медицины Министерства здравоохранения СССР проведена работа по определению этилового спирта в свежей крови. В основу спектрофотометрических определений был положен метод, рекомендованный указанными выше авторами,— спектрофотометрирование восстановленного спиртом бихромата калия.

Осуществляется исследование таким образом: в бюкс отмеривают 1 см³ поташа, а в тигель, поставленный в бюкс, — 2 см³ бихромата калия. Прежде чем герметически закрыть бюкс,- в него быстро вливают навеску исследуемой крови в количестве 1 см³ и легким вращением перемешивают ее с находящейся там навеской поташа. Бюкс помещают в термостат при температуре 50° на 30 минут. Если термостата нет, то бюкс на 3 часа оставляют в помещении при температуре 20°. При указанных условиях происходит полная диффузия спирта из исследуемой пробы в бихромат.

Одновременно с исследуемыми пробами крови приводятся: эталонные пробы — с известными количествами спирта (например, 0,4‰; 2‰; 2,5‰; 6‰) и контрольная («нулевая») проба чистая от алкоголя, поставленная с одними реактивами³.

По извлечении из термостата бюксы охлаждают до комнатной температуры⁴. Начиная с этого момента определение алкоголя в крови проводилось последовательно тремя приемами.

Первый прием заключается в простой визуальной оценке. Необходимо обратить особое внимание на то, что в практической работе не следует пренебрегать возможностью визуального определения алкоголя по степени окрашивания бихромата. Отсутствие алкоголя устанавливается по сохранению бихроматом ярко-оранжевой окраски. С увеличением количества спирта в анализируемых пробах окраска бихромата меняется от оранжевой — через различные желто-зелено-бурые оттенки — до темно-синей.

Окраска настолько характерна для определенных количеств этилового спирта в крови, что экспериментатор визуально устанавливает наличие алкоголя с точностью до 0,25%о. Оценка проводится непосредственно глазом через стеклянную крышку бюкса при несколько боковом освещении. Следует обращать внимание на окраску раствора бихромата около стенок тигля. В случае визуального приема на единичный анализ требуется не более 30—40 минут (т. е. время выдержки в термостате) . Таким образом, 15—20 анализов потребуют не более. l 1/2—2 часов.

Для перехода ко вторым двум приемам, основанным на объективном спектрофотометрировании, следует легким вращательным движением бюкса перемещать в тигле бихромат, снять крышку бюкса и содержимое тигля перенести в плоскопараллельные кюветы. Эксперимент должен проводиться быстро, посуда должна быть химически чистой.

Дальнейшие исследования сводятся к получению в разных областях спектра характеристик бихромата, содержащегося в кюветах.

Второй прием нами выполнялся на универсальном спектрофотометре (Ф. М. Модель) по всей области от 436 до 726 mμ (промежуточные фильтры имели равные — 465 mμ,, 496 mμ,, 533 mμ,, 574 mμ, 613 mμ и 655 mμ. Наиболее чувствительная область лежит в пределах λ=436—465 mμ. Предлагаемая Кигрелеем область λ=600 mμ, значительно менее чувствительна.

Таким образом, в практике количественные определения алкоголя надо проводить с фильтром λф =436 mμ, обычными графическими приемами (по эталонам). Спектрофотометрирование производится по отношению к «нулевой» пробе.

Градуировочные графики в области количеств алкоголя, имеющих судебномедицинское значение, можно считать прямолинейными. Анализ одной пробы в среднем занимает час. Применение этого приема для массовых анализов наиболее эффективно, так как для 15—20 проб требуется не более 3—31/2 часов. Ошибка анализа может колебаться (в зависимости от определяемых количеств) от 3 до 8%.

Третий прием нами применялся с использованием спектрографа (стеклянная оптика, средняя модель Хильгера) в области 336—668 mμ. Для фотометрирования пластинки (панхроматические, чувствительность ГОСТ-230) использовался микрофотометр МФ-2. Эти исследования увеличивают время, необходимое на анализ (за счет обработки пластинки, фотометрирования), но они расширяют возможности получения более точных и чувствительных измерений и утверждают в некоторых случаях специфичность. Этот прием дает возможность объективной протокольной записи результата анализа.

Устранить основной недостаток этого третьего приема — длительность проведения анализа при сохранении всех его преимуществ — можно, используя регистрирующие спектрофотометры.

Одновременными сравнительными анализами проб крови спектрофотометрическим методом и методом Видмарка установлено расхождение результатов (с разными дозами алкоголя) в пределах от 0,1 до 0,35‰.

Из элементов, мешающих определению спирта спектрофотометрическим методом, пока установлены (Фельдштейном и Клендшоу) паральдегид, формальдегид (особенно необходимо учитывать влияние формалина), метиловый спирт.

Спектрофотометрический метод в настоящее время нами положен в основу изучения возможности определения алкоголя в крови трупов, подвергшихся значительному гниению.

¹ G. Kindsleyet al., Analyt. Chem., 1951, 23, 914. О. Grtiner, Naturwiss, 1953, 40, 365. M. Feldsteina. N. Klendshoj. Canad. J. Med. Technol., 1954, 16. 48; Analytchem., 1954, 26, 932.

² Эти количества спирта в эталонных пробах ориентировочно соответствуют судебномедицинской градациям степени опьянения, когда при легкой степени опьянения в крови обнаруживается от 0,4 до 1‰ этилового спирта, при средней от 1 до 2,5‰ , тяжелой — от 2,5‰ до 6‰. Если в навеске крови установлено более 6%о спирта, то считается, что алкоголь — в смертельной дозе.

³ В качестве пробы можно брать 1 мл дистиллированной воды или 1 мл свежей крови, в которой заведомо отсутствует алкоголь. Однако изучение изолированной крови в различной степени гниения оставляет ошибку анализа в пределах средней ошибки эксперимента.

⁴ Используемые нами при осуществлении метода реактивы, посуда и аппаратура следующие. Растворы: раствор бихромата калия (3,37 г бихромата калия растворяют в 150 мл дистиллированной воды, затем, медленно перемешивая, добавляют 280 мл концентрированной серной кислоты. Полученный раствор разбавляют дистиллированной водой до 500 мл), 10% раствор поташа К2СО3, стандартный раствор спирта — 100 мл дистиллированной воды + 2,5 мл 96% этилового спирта (при температуре 21°) — 20‰. Посуда: стеклянные бюксы (15—20 штук) с притертыми крышками, диаметром а 4,5 см и высотой h-4 см, керамические тигли (15—20 штук) (d 1,5—2,5 см, h 2 см, бюретки (3 штуки) с притертыми кранами, градуированными с точностью до 0,1 г. Аппаратура: может быть использована любая имеющаяся в наличии в спектральной лаборатории — универсальный фотометр, спектрофотометры, спектрографы (в области 3500—6500А). Визуальная оценка наличия алкоголя с точностью до 0,25‰ не требует кроме глаза экспериментатора, никаких других оптических приборов. Любой термостат с температурным режимом 50°.