Определение селена в биологическом материале дитизонатным методом

Металлический селен и особенно его соединения высокотоксичны. Предельно допустимая концентрация селена в воздухе 2 мкг/л, а селенистого ангидрида 0,1 мкг/л. Известны случаи отравления соединениями селена. Наибольшую трудность при экспертизе представляют производственные интоксикации, при которых в организм попадают незначительные количества селена и его соединений главным образом через дыхательные пути и кожу. Изменения со стороны внутренних органов при этом не имеют характерной картины. В этих случаях экспертиза базируется главным образом на количественном определении селена в органах и тканях.

Судебные химики СССР не располагают методикой исследования биологического материала на селен.

Мы поставили перед собой задачу разработать специфичный метод определения малых количеств селена в органах человека. Одновременно необходимо было изучить оптимальные условия разрушения органических веществ, так как имеются указания, что селен во время минерализации теряется из-за летучести его в условиях восстановления и даже при высушивании объектов в мягких условиях (50—60°).

Описан ряд фотометрических и флюориметрических методов определения малых количеств селена. Для анализа биологического материала чаще всего используют достаточно чувствительные способы, основанные на реакциях взаимодействия селена с 3,3`-диаминобензидином, 2,3-диаминонафталином и 0-фенилендиамином. Наиболее чувствителен и специфичен второй метод (0,002 мкг/мл селена).

Однако все эти реактивы недостаточно избирательны по отношению к селену, сами реакции и отделение мешающих веществ требуют значительного времени. Используемые методы разрушения органических веществ громоздки и трудоемки.

В последние годы в аналитической химии ведутся интенсивные исследования по изучению методов определения малых количеств селена.

Д.П. Щербов и соавт. (1967) провели сравнительное изучение наиболее широко рекомендуемых методов определения селена и пришли к выводу о предпочтительном использовании дитизона. Количественное определение производят по одноцветной окраске дитизоната селена.

Метод определения по дитизонату почти так же чувствителен (0,08 мкг/мл), как и другие методы, например с диаминобензидином, диамннонафталином и т. д., но технически он проще и доступнее.

Дитизонат селена начинает экстрагироваться из 1 и. раствора кислоты. Оптимальная кислотность — 11 н. раствор серной кислоты или 6 н. раствор соляной кислоты. Определению мешают ртуть, золото, серебро, их следует предварительно удалять.

Присутствие до 5 мг железа не мешает определению селена по дитизонату, а 10 мг — завышает результаты до 6 %. Железо, медь, ртуть и другие катионы предварительно удаляют из сферы реакции, экстрагируя в виде дитизоматов при рН 2,5.

Определение селена дитиэоматным методом (n=6)

Растворы дитизоната селена устойчивы при хранении в темноте.

Закону Ламберта — Вера подчиняются концентрации селена 0,01—1 мкг/мл.

Недостаток определения селена до дитизонату — высокая окисляемость дитизона, образующего продукты окисления, которые обладают близким к дитизонату селена светопоглощением.

Максимум поглощения дитизоната селена при λ=420 нм, а продуктов окисления дитизона при λ=390 нм.

Мешающего влияния продуктов окисления можно избежать, используя хорошо очищенный дитизон. Очистка должна производиться обязательно перед определением. Очищенный дитизон хорошо сохраняется в холодильнике до 15 дней под слоем 1—2% раствора серной кислоты.

Опыты по экстрагированию дитизоната селена из водных растворов серной кислоты показали, что при содержании 0,05—10 мг селена в в 200 мл 4 н. раствора серной кислоты четыреххлористый углерод извлекает до 98% дитизоната селена при хорошей воспроизводимости и точности результатов определения (см. таблицу). Для определения достаточно 1—5 мл этого раствора, что позволяет использовать данную реакцию для дробного определения.

Органические вещества разрушали двумя методами: смесью концентрированных серной и азотной кислот и окислением биологического материала серной и азотной кислотами в присутствии хлорной кислоты.

Опыты подтвердили, что введение в реакцию 20 мл 42% раствора хлорной кислоты сокращает продолжительность разрушения органических веществ до 1,5—2 часов. Однако хлорная кислота не всегда доступна.

Предварительные опыты показали, что добавление молибдата натрия в окислительную смесь серной, азотной и хлорной кислот (В.В. Ковальский и В, В. Ермаков, 1966) не вызывает значительного ускорения разрушения органических веществ.

Окисление органических веществ серной и азотной кислотами проводили общепринятым методом. Хлорную кислоту добавляли до нагревания, а затем разрушение органических веществ осуществляли по схеме обработки серной и азотной кислотами.

Все опыты проводили с 50 г печени человека, содержащими 0,1—10 мг селена в пересчете на 100 г объекта.

Минерализат освобождали от окислов азота нагреванием с формалином и объем доводили водой до 100 мл.

Для устранения мешающего влияния соединений железа, всегда присутствующих в минерализате в больших количествах, соединений меди, а также возможного присутствия соединений ртути и других металлов, предварительно удаляли их в виде дитизонатов.

Методика

К 1—5 мл минерализата прибавляли водный раствор аммиака до рН 2,5 по 2,4-динитрофенолу и повторно экстрагировали 0,01% раствором дитизона в хлороформе. Последние фракции извлечения имели зеленый цвет, что указывало на полное удаление из сферы реакции сопутствующих и мешающих определению селена элементов. Полученные экстракты не исследовали. К обработанному описанным способом объему минерализата прибавляли концентрированную серную кислоту до

11 н. концентрации ее в растворе и экстрагировали селен 2 мин 0,01% раствором дитизона в четырех хлор истом углероде. Экстрагирование новыми порциями раствора дитизона производили до полного извлечения дитизоната селена, имеющего желтый цвет. Показателем полноты извлечения являлось сохранение первоначального зеленого цвета раствора дитизона в четыреххлористом углероде. Экстракты объединяли, промывали 1% раствором аммиака до бесцветной водной фазы, а затем 4 н. раствором серной кислоты. Измеряли объем экстракта и плотность его на фотоэлектроколориметре ФЭК-Н в кюветах с толщиной слоя 10 мм при 420 нм.

По калибровочному графику определяли количество селена в трупном материале. Растворы дитизоната селена в четыреххлористом углероде не изменяются в течение 2—3 часов, но легко разлагаются на солнечном свету с образованием продуктов окисления дитизона. Колориметрировать следует тотчас после окончания экстрагирования дитизоната.

Результаты опытов приведены в таблице.

При исследовании печени селен определяется дитизонатным методом достаточно точно в широких пределах концентраций — от 0,1 до 10 мг и более в 100 г органа. Из таблицы следует, что селен не теряется во время разрушения органических веществ серной, азотной и хлорной кислотами, а также при разрушении их общепринятым методом окисления серной и азотной кислотами. Относительная ошибка при определении 0,1 мг селена в 100 г печени составляет 11,7%, 1 мг — 6% и 10 мг — 5%.

Метод позволяет определять 2,5 мкг селена в объеме минерализата, соответствующем навеске органа 2,5 г.

Разработанный метод обладает большой чувствительностью и достаточно высокой точностью, может применяться для исследования как больших, так и относительно небольших навесок трупного материала, что имеет значение для судебно-медицинской экспертизы с учетом длительности течения интоксикации и пути введения селена.

Затрата времени на минерализацию в присутствии хлорной кислоты 1 —2 часа, на определение — не более 1,5 часов.

Выводы

1. Разработан простой фотоколориметрический метод определения селена в биологическом материале, основанный на использовании реакции образования дитизоната его.
2. Селен не теряется в процессе разрушения органических веществ, как общепринятым в судебно-химической практике методом окисления серной и азотной кислотами, так и при разрушении в присутствии хлорной кислоты.