Газохроматографический анализ спиртов в крови и моче методом абсолютной калибровки с пробомером

В газовой хроматографии существует три метода расчета хроматограмм: абсолютной калибровки, внутреннего стандарта и внутренней нормализации. Для количественного анализа спиртов в биологических объектах предлагается использовать метод внутреннего стандарта. В качестве внутреннего стандарта применяется 4% раствор пропилового спирта. Для анализа в газовый хроматограф вводят пары, находящиеся в равновесии с жидкой фазой. Содержание паров вещества над жидкостью пропорционально коэффициенту распределения этого вещества между жидкостью и паром, причем при изменении темпера туры окружающей среды изменяется и коэффициент распределения. В результате изменяется и относительное содержание стандарта в паровой фазе, что, несомненно, должно приводить к ошибкам хроматографического анализа. Кроме того, если в исследуемом объекте содержится пропиловый спирт, возникает необходимость в замене внутреннего стандарта. К числу недостатков метода относится и двукратное введение анализируемой пробы, поскольку вначале проводится качественная, а затем количественная оценка результата.

Мы предлагаем для анализа спиртов C1—с5, в частности этилового спирта, метод абсолютной калибровки. При введении пробы с помощью медицинского шприца возникают неизбежные потери пробы, связанные с токсическими погрешностями, причем величина этих потерь в каждом случае различна и невоспроизводима. Поскольку точность анализа зависит от воспроизводимости ввода пробы, это обстоятельство не может не отразиться на точности результатов. Для устранения зависимости результатов измерения от ввода пробы мы использовали принцип пробомера.

Измененная схема газохроматографа.
1 — регулятор давления; 2 — вентиль тонкой регулировки: 3 — устройство для ввода проб; 4 — сравнительное плечо катарометра (пробомер); 5 — разделительная колонка; 6 — рабочее плечо катарометра; 7 — самопишущий прибор.

Обычно сравнительное плечо катарометра включается в газовую линию до устройства для ввода пробы; в случае включения его после испарителя, непосредственно перед разделительной колонкой, проба будет попадать на сравнительное плечо катарометра не разделяясь и пик от сравнительного плеча катарометра будет служить индикатором объема введенной пробы — пробомером. Затем проба попадает на разделительную колонку, и с помощью рабочего плеча катарометра регистрируется обычная хроматограмма (см. рисунок). Отношение высот получаемых пиков к высоте пика пробомера (или отношение каких-либо других параметров, например, площадей пиков) величина в известных пределах постоянная, не зависящая от величины вводимой пробы.

Сравнительные результаты определения этилового спирта в крови и моче методом внутреннего стандарта и абсолютной калибровки

Методика. 0,5 мл объекта помещали в пенициллиновый флакон с 0,5 мл 50% раствора трихлоруксусной кислоты. После перемешивания и фиксации пробки во флакон с помощью шприца вводили 0,25 мл 30% раствора нитрита натрия. После минутного взбалтывания отбирали 2 мл парообразной пробы (газ-носитель — гелий) и вводили в хроматограф. Масштаб записи пика общего количества пробы 128, полярность записи — «обратная». После записи пика общего количества пробы (пика пробомера) масштаб записи переводят в положение 2, а полярность записи — в положение «прямая». В этих условиях регистрируется остальная хроматограмма, Первым из колонки выходит пик воздуха, а затем последовательно — спирты от С1 до С5. Для количественного анализа спиртов необходима предварительная градуировка хроматографа; с этой целью приготовляют искусственные смеси с различным содержанием определенных веществ и строят градуировочный график в координатах:

где h_i — высота пика, соответствующего определенному веществу: h₀ — высота пика пробомера; C_i — концентрация вещества в пробе.

В процессе проведения анализа по хроматограмме рассчитывают величину h₁/h₀, а по градуировочному графику определяют искомую концентрацию. При количественном анализе остальных спиртов необходимо построить градуировочный график для каждого спирта в отдельности.

Количественно-качественный анализ всех спиртов от С1 до С5 возможен на основе одной хроматограммы. Предлагаемый метод может быть осуществлен на любом из хроматографов с детектором по теплопроводности.

Метод проверен нами при качественно-количественном анализе алкилнитратов в крови и моче.

Условия хроматографического разделения. Хроматограф ХЛ—69 с детектором по теплопроводности, колонка V-образная, длина 1,2 м. Неподвижная фаза — полиэтиленглюкон 1200 на ИНЗ—600, температура колонки 75°, сила тока детектора 60 мА, газ-носитель — гелий, 3 л/ч.

Условия регистрации. При записи пика пробомера масштаб регистрации устанавливается в положение 128, полярность записи «обратная». При записи остальной хроматограммы масштаб регистрации устанавливается в положение 2, полярность «прямая». Ошибка анализа не превышает 2% (см. таблицу).

Выводы

1. Предлагаемый метод качественно-количественного определения спиртов С1—С₅ в крови и моче позволяет при однократном введении пробы проводить количественную оценку всех спиртов, содержащихся в объекте.
2. Проверка метода на лабораторном хроматографе ХЛ-69 показала, что ошибка анализа не превышает 2%.