Количественное определение карбоксигемоглобина в разные сроки после смерти в судебномедицинской практике

В ряде случаев качественная проба на СО при судебномедицинском исследовании оказывается недостаточной и должна быть дополнена более точным количественным определением. Можно ли обнаружить карбоксигемоглобин спустя более или менее значительный срок после смерти, и насколько близки получаемые величины к первоначальным— это зависит от выбранного метода определения. Так, например, имеется указание, что при использовании метода Никлу (Nicloux), основанного на сжигании выделяемого из крови СО, можно с большой точностью определить содержание COHb спустя очень длительный (до 2 лет) срок после смерти. С другой стороны, спектрофотометрический мет Хюфнера уже через несколько дней после смерти дает неверный результат. Подробный обзор существующих методов количественного определения COHb приводит Массман (Massman, 1956).

Рис. 1. Установка для получения СО и затравливания животных.

В настоящей работе проверялась пригодность метода Вольфа для такого рода определений. Помимо определения по методу Вольфа, СО находили спектрофотометрически по методу, недавно предложенному Фретвурстом и Майнеке (Fretwurst, Meinecke, 1959).

Подопытных белых крыс затравливали угарным газом, полученным из муравьиной кислоты, которую вливали небольшими порциями в нагретую до 100° концентрированную серную кислоту. Выделяющийся газ промывали щелочью и водой и сушили безводным хлористым кальцием. Установка для затравливания крыс изображена на рис. 1. Крысы погибали примерно через минуту после помещения в затравочную камеру. Та же установка использовалась для получения стандартных образцов крови с известным содержанием СОН.

Определение по методу Вольфа

Этот метод, предложенный в 1941 г., основан на том, что при определенных pH и температуре O₂Hb выпадает в осадок быстрее, чем COHb. Таким образом, эти два вещества можно отделить друг от друга и оставшийся в растворе COHb определить колориметрически. Позднее эта методика была проведена Кастаньоном и Гольсом (Castagnon, Golse, 1952), которые нашли наиболее благоприятными для определения следующие условия: pH = 4, 95, температура = 55—60°, время 10—15 минут. В остальном же они, как и другие авторы, подтвердили применимость и специфичность метода Вольфа.

В настоящей работе определение СОНЬ по методу Вольфа производилось следующим образом. Прежде всего была построена калибровочная кривая. Для этой цели приготовляли растворы различной степени разведения из образца крови с известным (определенным по Сали) содержанием гемоглобина и измеряли фотоколориметром ФЭК-М их светопоглощение.

Полученная калибровочная кривая приведена на рис. 2, а ее построение указано в табл. 1.

Рис. 2. Калибровочная кривая для определения COHb по методу Вольфа (кювета 0,5 см, зеленый светофильтр).

Таблица 1

Построение калибровочной кривой для определения концентраций O₂Hb и СОHb в крови

¹ Эти точки получены при измерении крови, не содержащей COHb; остальные — при измерении стандартных образцов с известным содержанием СОНЬ, обработанных по описанной методике. Условия измерения; кювета 0,5 см, зеленый светофильтр.

В исследуемом образце крови необходимо определить содержание Hb, так как его концентрация в трупной крови может сильно меняться. Для этой цели кровь разбавляют в 50—100 раз, измеряют ее светопоглощение и по калибровочной кривой находят выраженную в грамм-процентах концентрацию гемоглобина в этом разведенном растворе.

Для определения COHb кровь разбавляют 0, 24% раствором лимоннокислого натрия в 5—10 раз и 1 мл разбавленного раствора вносят в пробирку, в которой предварительно смешивают 1 мл 5 N раствора уксусной кислоты и 3 мл 3 N раствора уксуснокислого натрия. После внесения крови пробирку закрывают пробкой, осторожно перевертывают 2—3 раза и помещают на 5 минут в водяную баню, нагретую до 55°. Выработанные однажды условия температуры и времени должны точно соблюдаться. Затем раствор охлаждают в холодной воде, выпавший осадок отфильтровывают и оставшийся в растворе COHb определяют фотометрически, т. е. по найденной величине светопоглощения на калибровочной кривой находят концентрацию в грамм-процентах, найденная величина после умножения на 5 дает концентрацию COHb в грамм-процентах в растворе крови выбранного разведения (в 5—10 раз). Найденную величину концентрации COHb нужно сопоставить с найденной ранее концентрацией Hb, учитывая различное разведение растворов. Разделив первую величину на вторую, мы получаем процент насыщения гемоглобина угарным газом:

COHb (в г%) / Hb (в г%) = COHb (в %).

Определение COHb по методу Фретвурста и Майнеке

Метод основан на определении поглощения света при длине волны, равной 575 или 578 ???mм, раствором гемолизированной крови до и после восстановления O₂Hb гидросульфитом. В случае 100% насыщения крови угарным газом величина поглощения света после добавки гидросульфита не меняется. При неполном насыщении или при отсутствии СО она уменьшается. По степени этого уменьшения определяют процент COHb в исследуемом образце.

Реактивами при определении COHb служат 0,1% раствор аммиака, гидросульфит натрия (чистый для анализа), 30% раствор щелочи (NaOH).

Кровь разбавляют 0, 1% раствором аммиака (приблизительно 0, 6 мл крови на 100 мл раствора аммиака). После гемолиза раствор должен быть совершенно прозрачным. Если он мутен (старая кровь), его центрифугируют. Прозрачный раствор разбавляют 0,1% раствором аммиака до такой степени, чтобы при измерении в спектрофотометре получить величины порядка 0,75—1. Тщательно измеряют светопоглощение, учитывая поглощение самой кюветы, при точно установленной длине волны 575 или 578 mµ. Затем к 10 мл до такой же степени разведенного раствора крови добавляют 20—30 мг гидросульфита натрия и 0, 1 мл 30% едкого натра (3 капли). Не раньше чем через 15 минут измеряют светопоглощение этого раствора. Вычисляют, какой процент составляет второе поглощение по отношению к первому, и по калибровочной кривой находят процент COHb. Измерения проводят спектрофотометром СФ-4.

Построение калибровочной кривой

Измеряют поглощение света раствором крови, не содержащей угарного газа и насыщенной им на 100%, до и после прибавления гидросульфита натрия. Второе измерение (после добавки гидросульфита) выражается в процентах от первого. Это дает конечные точки (0—100%) калибровочной кривой. Промежуточные точки рассчитывают по формулам, приведенным в табл. 2.

Таблица 2

Построение калибровочной кривой для определения COHb по методу Фретвурста и Майнеке

Калибровочная кривая для определения COHb по методу Фретвурста и Майнеке приведена на рис. 3.

Рис. 3. Калибровочная кривая для определения процента COHb по методу Фретвурста и Майнеке (длина волны 575 mµ).

В табл. 3 сопоставлены результаты определений СОНЬ в крови крыс, взятой на определение сразу после смерти от отравления СО. Результаты получены двумя вышеописанными методами. Из табл. 3 видно, что практически они полностью совпадают.

Однако можно было предполагать, что методом Вольфа не удастся получить правильных результатов через более или менее длительный срок после смерти, так как этот метод основан на различной растворимости гемопротеинов O₂Hb и СОНЬ, которая, конечно, должна меняться при изменениях белковой части молекулы. А такие изменения, безусловно, имеют место при посмертном разложении тканей. Проведенные опыты подтвердили это предположение.

Таблица 3

Определение COHb непосредственно после отравления СО

¹ Кровяную жидкость из тканей готовят следующим образом: ткань нарезают ножницами и заливают небольшим количеством 0, 1 % раствора аммиака. Затем раствор отфильтровывают или центрифугируют. Полученный раствор крови должен быть совершенно прозрачным. При большом содержании гликогена в печени раствор может получиться мутным. В этом случае определить СО описанным методом невозможно.

Табл. 4 показывает, что уже при взятии материала через 48 часов после смерти величины, полученные методом Вольфа, являются сильно заниженными. Спектрофотометрический метод Фретвурста и Майнеке, основанный на окислительно-восстановительных свойствах O₂Hb и COHb, оказывается в этих условиях более применимым.

Таблица 4

Содержание COHb в разные сроки после смерти от отравления СО (при 20°)

Из полученных данных следует, что метод спектрофотометрического определения COHb, предложенный Фретвурстом и Майнеке, дает вполне достоверные результаты при исследовании материала, взятого в сроки до 3 суток после смерти.

Удовлетворительные результаты по методу Вольфа получены лишь при исследовании материала, взятого в течение суток после смерти. Для определения СОНЬ через сроки, превышающие 3 дня, более пригодными, вероятно, окажутся методы, основанные на определении выделяемой из крови окиси углерода (в противоположность методам, основанным на непосредственном определении карбоксигемоглобина).