Методики выявления микробной флоры в гистологических микропрепаратах

После депарафинирования срезов(три порции ксилола,затем этанол нисходящей концентрации, окрашенные срезы заключаются в бальзам(быстрое осушение фильтровальной бумагой,быстрое обезвоживание 96% этанолом,просветление ксилолом и заключение в бальзам).

 

1.Окраска метиленовым синим по Леффлеру

 -срез поместить в краситель(30 мл насыщенного, примерно 10%-го спиртового р-ра

  метиленового синего + 100 мл 0,015-го едкого калия) на 5-10 мин,

 -дифференцировать в 0,25-0,5% р-ре уксусной кислоты под контролем микроскопа-

  несколько секунд)

 -сполоснуть водой

 -заключить в бальзам.

 

2.Окраска тионином по Нисслю

  -срез поместить в краситель(1 мл насыщенного, примерно 10%-го спиртового р-ра тионина+ 10 мл 1%-го водного фенола) на 3-10 мин

  -обезводить и дифференцировать 96% этанолом под контролем микроскопа 0,5-2 мин.

  -заключить в бальзам.

РЕЗУЛЬТАТЫ: При обеих окрасках ядра клеток окрашиваются отчетливо,цитоплазма клеток и остальные компоненты тканей почти не видны.Выявляются грамположительная и грамотрицательная флора,причем первая окрашивается интенсивнее.

 

3.Окраски основным фуксином.

Возможно несколько вариантов окраски,в основе которых лежит применение насыщенного  примерно 10%-го р-ра основного фуксина на 96% этаноле(НРОФ).

3а Окраска по Пфейферу

-срез поместить в краситель(0,1 мл НРОФ + 100 мл 5% водного фенола) на 5 мин.

-сполоснуть водой

-дифференцировать разведенным солянокислым этанолом-1 часть соляно-кислого

 этанола(1% соляная кислота в 70% этаноле) на 4 части дистиллированной воды

 (дважды налить)

-смыть водой

-заключить в бальзам.

РЕЗУЛЬТАТЫ: Ядра клеток и бактериальная флора,особенно грамположительная,окрашиваются в малиновый цвет,цитоплазма клеток и другие компоненты клеток почти не видны.

 

3б Окраска по Цилю-Нильсену:

 -срез покрыть фильтровальной бумагой(ее края не должны заходить за край стекла)   на бумагу налить раствор карболового фуксина(1 часть НРОФ на 10 частей 5%-го  водного фенола),срез подогреть до появления паров,оставить краску на срезе еще на     20-30 минут или срез без подогревания оставить в красителе на 15-18 часов

 -снять бумагу,сполоснуть срез в воде

 -дифференцировать в 1%-м соляно-кислом спирте(1 часть солянокислого этанола-  1% соляная к-та в 70% этаноле на 4 части дистиллированной воды) до бледно-розового цвета

 -промыть в воде

 -окрасить гематоксилином или метиленовым синим по Леффлеру

 -сполоснуть в воде

 -заключить в бальзам

 РЕЗУЛЬТАТЫ:ткань красится гематоксилином или метиленовым синим,кислото- и спиртоустойчивые бактерии(в частности,туберкулезные),и ооцисты криптоспоридий-малиновые.

 

3в Окраска основным фуксином-метиленовым синим

Окраска применяется главным образом для мазков,но применима при парафиновой проводке,если не загрязнены спирты.

-срез поместить в краситель(10 мл дистиллированной воды ,к которой добавлены 1-2 капли НРОФ и 3-4 капли насыщенного примерно 10%-го р-ра метиленового  синего. Смесь красок имеет синий цвет с фиолетовым оттенком. Р-ры приготавливаются по Селлеру на этаноле, при модификации Павловского - на метаноле: до употребления они должны созревать не менее 1 недели в теплом месте)на 0,5-5 мин под контролем микроскопа

-заключить в бальзам.

РЕЗУЛЬТАТЫ: ядра сине-фиолетовые,цитоплазма сиреневая,микроорганизмы синие(более темная грамположительная флора и светлее-грамотрицательная)Кроме того, при ОРВИ в цитоплазме пораженных клеток выявляются малиново-красные ФВ-включения.

 

4. Окраски анилиновым фиолетовым.

Метод широко применим в бактериологии для разделения всех видов бактериальной флоры на грамположительную и грамотрицательную.В патологической анатомии метод имеет дополнительное значение ввиду того,что тинкториальные свойства микрофлоры меняются на противоположные ввиду посмертных изменений.

4а Окраски по Граму и Граму-Вейгерту

-срез поместить в раствор анилинового фиолетового(1 мл анилина и 10 мл дистиллированной воды взболтать в пробирке 1-2 мин,профильтровать через влажный фильтр,к прозрачному фильтрату добавить 1 мл насыщенного(примено 10%-го или,что хуже,генцианового фиолетового или метилового фиолетового(приготовленная краска сохраняется около 10 суток,а насыщенный раствор-неограниченно долго)-на 2-5 минут

-краску слить

-сполоснуть водой

-налить раствор Люголя(1 г йода+2 г йодистого калия+300 мл дистиллированной воды)-до почернения,около 1 мин

-хорошо,но быстро просушить фильтровальной бумагой

-дифференцировать-удалить избыток красителя 96% этанолом(при окраске по Граму),анилином(при окраске по Граму-Вейгерту) ,смесью анилина и ксилола(в соотношении 1:1) для меньшей скорости обесцвечивания или по модификации автора с дифференцировкой вначале 96% этанолом(на препарат налить 2-5 капель и быстро слить,а затем анилин-ксилолом.).

Преимущество последнего способа дифференцировки в том,что микроорганизмы окрашиваются интенсивнее(грамположительная флора делается почти черной), фибрин же окрашивается почти также,как при методике Грама-Вейгерта.Дифференцировку проводить до прекращения отхождения синеватых полос из извлекаемой краски при покачивании стекла

-хорошо промыть ксилолом,повторно наливая его на стекло(иначе через несколько суток бальзам начнет окрашиваться в интенсивно-желтый цвет,сам же срез постепенно обесцвечивается)

-заключить в бальзам.

 Далее обычно производится дополнительная окраска тканей. Для этого срез окрашивают: 

а)после окраски анилиновым фиолетовым раствором кармина по Гренхагеру (3-5 г аммиачных или калийных квасцов растворить в 100 мл дистиллированной воды + 1 г кармина ,кипятить 1 час,после охлаждения профильтровать и добавить 1 мл 40% формалина)- на 2-24 часа или литиевого по Орту(2-5 г кармина всыпать в 100 мл насыщенного-около 1,5%-го водного раствора углекислого лития ,прокипятить, после охлаждения профильтровать)- на 5-10 мин.При загрязнении растворов кармина,в частности,из-за размножения в них грибов,эти р-ры можно применять после кипячения с последующим фильтрованием.

РЕЗУЛЬТАТЫ:Ядра клеток красноватые,иногда с синеватым оттенком,цитоплазма светлая или серовато-синеватая.Грамположительная флора темно- синяя,грамотрицательная-при докраске раствором карболового фуксина-красная.При докраске раствором кармина-сероватая.Критерием полноценности выявления грамположительной микрофлоры  при окраске по Граму-Вейгерту является отчетливое выявление фибрина,что целесообразно учитывать при контроле за ходом дифференцировки.  

 

4б    Окраска по Браун-Брену( в модификации О.К.Хмельницкого)

-срез поместить в железный гематоксилин Вейгерта на 2-4 мин

-прополоснуть в воде

-дифференцировать в 1% р-ре соляной кислоты

-поместить в воду на 3 мин

-окрасить карболовым анилиновым фиолетовым(в маленькой бутылочке смешать 5 капель 5%-го бикарбоната натрия,содержащего 0,5% фенола+ 0,75 мл 1%-го водного раствора анилинового фиолетового)-5-10 мин

-смыть водой

-налить р-р Люголя на 1 мин

-смыть в 96% этанолом

-дифференцировать в смеси анилина и 96% этанола(1:1)

-смыть 96% этанол-промыть водой-окрасить очень быстро раствором основного фуксина(5 мл НСРФ+ 100 мл  дистиллированной вроды

-смыть 96% этанол

-дифференцировать 1% спиртовым раствором пикриновой кислоты до тех пор,пока не перестанет отходить краска

-заключить в бальзам

РЕЗУЛЬТАТЫ: ядра клеток окрашиваются в черно-коричневый цвета, цитоплазма - в желтый. Грампложительные грибы и бактерии окрашиваются в сине-лиловый, почти черный цвет, грамотрицательные-в красно-лиловый.

 

5 Окраска азуром и эозином

-срез поместить в краситель(свежеприготовленная смесь 0,1% р-ров азура-2 и водорастворимого эозина,лучше эозин-экстра или калия) на 18-24 часа при комнатной температуре(или на 20-30 мин при 37 град С)

-дифференцировать слабым раствором уксусной кислоты(1 мл 1% уксусной кислоты на 100 мл воды)-быстро

-заключить в бальзам

РЕЗУЛЬТАТЫ: ядра клеток окрашиваются в темно-синий цвета, цитоплазма-розовая, эритроциты оранжевые, микрофлора, в основном, бактериальная-синего цвета разной интенсивности.

 

6 Окраска эозиново-кислым метиленовым синим с докараской азуром и эозином(по Папенгейму)

-на срез нанести 20-30 капель красителя Май-Грюнвальда(25 сухого красителя эозиново-кислого метиленового синего растворить в 100 г этанола при легком нагревании в водяной бане при 60 град С, при необходимости приготовления сухого красителя 1 г эозина и 1 г метиленового синего растворяют в 1 л дистиллированной воды, образующийся при этом темно окрашенный осадок -после отсасывания отстоять несколько суток-промывают холодной дистиллированной водой и высушивают на 1-3 мин.

- наливают такое же кол-во дистиллированной воды на 1 мин, сливают, не смывая

-докраска азуром-эозином (смесь-10 мл  0,1% р-ра эозина +14 мл 0,1% р-ра азура + 0,7 мл 0,2 М раствора уксусной кислоты+0,4 мл 0,2М р-ра уксусно-кислого натрия + 5 мл ацетона +20 мл дистиллированной воды)на 35 мин в термостате

-промыть водой

-заключить в бальзам

РЕЗУЛЬТАТЫ: ядра красновато-фиолетовые, цитоплазма розовая. Бактериальная микрофлора синего цвета разной интенсивности.

 

7 Окраска с использованием фуксинсернистой кислоты(ШИК-реакции)

Принцип метода:образование соединений фуксинсернистой кислоты с альдегидными группами соединений лилово-красного цвета.Последние возникают при окраске простейших и грибов.Лучше применять периодат калия(окраска по Шабадашу)

Окраска по Шабадашу.

-срез промыть дистиллированной водой

-поместить в р-р перйодата(400 мг йоднокислого калия или натрия+10 мл 0,2 нормального р-ра уксусной к-ты,на дне остается осадок)-на 5-10 мин

-сполоснуть в дистиллированной воде 3-10 мин

-пломестить в фуксинсернистую кислоту(! г чистого основого фуксина для фуксинсернистой кислоты,растертого в ступке до мелкого порошка,залить 210 мл кипящей дистиллированной воды,после взбалтывания в течение 5 мин остудить до 60-70 град С,затем профильтровать  через фильтровальную бумагу,охладить до 50 град С,затем добавить 20 мл 1 нормальной соляной кислоты,охладить до 20-25 град С,добавить 1 г метабисульфита калия илои безводного бисульфита натрия.Раствор,вначале рубиново-красный,постепенно обесцвечивается,до полного обесцвечивания его держать плотно закрытым в темном прохладном месте от 12 час до 3 сут,фуксинсернистой кислотой можно пользоваться повторно,если она остается бесцветной--на 10-30 мин

-промыть в дистиллированной воде

-хорошо промыть в сернистой воде(200 мл водопроводной воды+10 мл 10%-го метабисульфита натрия + 10 мл 1 норм.соляной кислоты,сернистой водой можно пользоваться повторно при хранении ее в плотно закрытой посуде.

-окрасить гематоксилином,напр.,Гарриса,с последующей дифференцировокой 1% водным раствором соляной кислоты и промывкой в щелочной воде до восстановления синеватой окраски ядер

-заключить в бальзам

РЕЗУЛЬТАТЫ: Препараты, окрашенныве по данной методике,напоминают окрашенные гематоксилином и эозином.Ядра клеток темного синевато-серого цвета, цитоплазма бледно-фиолетовая.Микоплазмы,грибы рода кандида, пневмоцисты, токсоплазмы,слизь,окрашиваются в красно-фиолетовый цвета,плесневые грибы, некапсулированные бактерии окрашиваются только гематоксилином.

8  Методы выявления НВ  антигена

8а Окраска орсеином

Данная окраска имеет наибольшее значение для диагностики гепатита В

Окраска по Шиката.

-срез поместить в 1-й раствор(9,5 мл 5%-го марганцовокислого калия+5 мл 3%-го раствора серной кислоты+85 мл дистиллировавнной воды)-на 10 мин

-поместить в 2% щавелевую кислоту на 10 мин

-промыть в проточной воде 5 мин,затем в двух порциях дистиллированной воды и двух порциях 70%-го этанола

-на срез налить краситель(орсеин 4 г,70% этанол-100 мл,концентрированной соляной кислоты - 2 мл) - на 4 часа

-промыть в проточной воде 10 мин

-дифференцировать солянокислым этанолом

-заключить в бальзам

РЕЗУЛЬТАТ: в цитоплазме гепатоцитов на светло-коричневом фоне тканевых элементов выявляются крупные округлые темно-коричневые включения однородного строения. Аналогично окрашиваются ядра лимфоцитов в перипортальных инфильтратах

Эластические волокна, медно-белковые комплексы окрашиваются также в коричневый цвет.

Рез-ты во многом определяются качеством красителя. Встречаются реактивы, не окрашивающие специфический субстрат. Поэтому при смере реактива необходимо апробировать его на материале, где уже был получен положительный результат.

Редко реактив пригоден более 2 недель,поэтому нужен свежий. Но все же встречаются орсеины, окрашивающие цитоплазму гепатоцитов диффузно, особенно на секционном материале. Поэтому предложены другие методы.

  

8б Окраска резорцин-фуксином (по Сенба,1982 г)

( А.С.Логинов, Аруин Л.И. Клиническая морфология печени.М.,Медицина,1985 г,с.12)

1.Фиксация в 10% формалине,заливка в парафин

2.Обработка депарафинированных срезов течение 10 мин в смеси,содержащей из 5% перманганата калия(9,5 мл),3% серной кислоты(5 мл),дистиллированной воды до 100 мл

3.Обесцвечивание срезов в течение 10 мин в 2% щавелевой кислоте

4.Промывка в проточной воде

5.Сенсибилизация(в 2% железо-аммонийных квасцах или в 1% нитрате уранила)

6.Помещение срезов на 1-3 часа в раствор резорцин-фуксина.

Приготовление раствора:

К 200 мл 1% раствора основного фуксина добавляют 5 г резорцина.Раствор кипятят в широкой чашке(диаметром 25 см) при постоянном перемешивании примерно 30 мин (пока объем не уменьшится вдвое),затем добавляют 25 мл 29% раствора хлорида железа и кипятят еще 5 мин.Охлажденный раствор фильтруют и осадок промывают на том же фильтре дистиллированной водой до тех пор,пока вода не перестанет окрашиваться.

Осадок вместе с фильтром заливают 200 мл абсолютного спирта и кипятят в водяной бане 2-5 мин,восстанавливают объем испарившегося абсолютного спирта(до 200 мл) и добавляют 4 мл НС1.Дифференцируют окрашенные срезы абсолютным спиртом, затем 1% солянокислым спиртом 5 мин.После этого промыввают в воде,обезвоживают и заключают в бальзам.

РЕЗУЛЬТАТЫ: НВ  антиген,эластические волокна,желчные пигменты темно-синие или черные.

 

8в Высокоспецифичный метод для выявления НВ  антигена по (                 ,1982 г)

1.Депарафинированные  и доведенные до воды срезы обрабатывают метанолом,содержащим 0,6% перекиси водорода,в течение 20 мин для подавления эндогенной пероксидазы.

2.Промывают в трех сменах фосфатного буфера(рН 7,2)

3.Инкубируют в растворе пероксидазы(5 мг на 100 мл),нанесенном на срезы,в течение 30 мин при комнатной температуре во влажной камере

4.Промывают в буфере

5.Обрабатывают диаминобензидином

6.Промывают в буфере

7.Докрашивают ядра гематоксилином Майера

РЕЗУЛЬТАТЫ: включения НВ  антигена темно-коричневого цвета

 

9 Импрегнация азотнокислым серебром

Для выявления бактериальной флоры с успехом может быть применена импрегнация серебром,что может осуществиться как в тканях,так и в срезах.

9а Импрегнация по Левадити

-кусочки тканей после фиксации хорошо промывают в воде-не менее 1 суток

-поместить в 96% этанол на 1 сут

-перенести в дистиллированную воду до удаления этанола(до тех пор,пока кусочки не потонут,но не более 1 сут)

-поместить в 2-3% р-р азотнокислого серебра в темной,наглухо закрытой банке при температуре 37 град С на 3-4 суток

-быстро сполоснуть в растворе пирогалловой кислоты(3-4 г+95 мл дистиллированной воды+5 мл 40%-го раствора формалина).затем положить в него при комнатной температуре на 1 сут

-промыть в воде

-залить в парафин

-приготовить срезы и заключить в бальзам

РЕЗУЛЬТАТЫ:ткань окрашивается в желто-коричневый цвета,бактерии-в черный

 

9б Импрегнация по Вартину-Старри

-срез поместить в подкисленную воду(рН 3,8-4,4 бидистиллированная вода или кипяченая дистиллированная вода подкисляется 1% раствором лимонной кислоты)

-поместить в 1% раствор азотнокислого серебра в стаканчике,обернутом черной бумагой и предварительно подогретом до 43 град С,перенести в водяную баню или термостат при температуре 43 град на 30 мин

-срезы положить  на стеклянные палочки и покрыть проявителем(готовится непосредственно перед употреблением в маленьком стаканчике,при сливании помешивается стеклянной палочкой предварительно нагретые в термостате до 56 град С 4 мл 2%-го раствора азотнокислого серебра+10 мл 5%-го желатина+5,4 мл 0,15% раствора гидрохинона),проявить в термостате при 56 град С без доступа света 5-12 мин(до приобретения срезов золотисто-коричневого или золотисто-желтого цвета)

-быстро и тщательно ополоснуть в подогретой до 56 град С водопроводной воде

-обезводить в этаноле восходящей крепости(70,96 и 100%0-по 15 мин

-заключить в бальзам.

РЕЗУЛЬТАТ: на желтом фоне выявляются черные бактерии

 

9в Импрегнация в срезах с докраской по Семенович(с докраской гематоксилином и эозином)

-срез поместить в 0,008 М ацетатного буфера с рН 3,6-соединить 18,5 мл 0,2 М уксусной кислоты(1,2 г кислоты растворить в 100 мл дистиллированной воды)+1,5 мл 0,2 М ацетата натрия(1,64 ацетата натрия растворить в 100 мл дистиллированной воды)+500 мл кипяченой дистиллированной воды-на 2 мин

-поместить в 1% раствор азотнокислого серебра в темной посуде при 56 град С-на 30 мин 

-срез положить на стеклянные палочки и покрыть проявителем(15 мл 5%-го желатина+3 мл 2%-го азотнокислого серебра+1 мл 3%-го гидрохинона,при сливании помешивать стеклянной палочкой) при температуре 37 град С-10 мин

-промыть в двух порциях теплого ацетатного буферного раствора

-поместить в 5% раствор тиосульфата натрия

-промыть в дистиллированной воде 5 минут

-окрасить гематоксилином и эозином

-заключить в бальзам

РЕЗУЛЬТАТЫ:бактерии окрашиваются в черный цвета,ткани окрашены гематоксилином и эозином,но с желтоватым оттенком цитоплазмы и волоконистых структур

 

10 Выявление возбудителей иммуноферментным методом

-срезы депарафинировать в ксилоле с последующим помещением в химически чистый ацетон

-обработать перекисью водорода(1,5-25 раствор пергидроля)

-нанести указанную сыворотку(в разведении,указанном в инструкции к ней),содерджащую антитела к возюбудителю,инкубировать в термостате при 37 град С в течение 45 мин

-нанести антивидовую сыворотку,меченную пероксидазой(в разведении,указанном в

инструкции к сыворотке),инкубировать во влажной камере при 37 град С 45 мин

-промыть фосфатным буфером дважды по 10 мин

-обработать раствором диаминобензидина-ДАБ(5 мг на 10 мл 0,1 М трис-буфера с добавлением 3-4 капель 0,2% пергидроля) на 4 мин

-промыть фосфатным буфером быстро

-обработать 0,1% раствором четырехокиси осмия для более четкого контрастирования 3-4 мин

-промыть физраствором,затем дистиллированной водой

-окрасить гематоксилином или при необходимости другим ядерным красителем,заключить в бальзам

РЕЗУЛЬТАТЫ: возбудитель - коричневый разной степени интенсивности, фон-синеватый

 

11 Выявление возбудителей с помощью люминесцентной микроскопии

Лучше исследовать мазки-отпечатки,а еще лучше-соскобы из поверхности органа,предварительно высушенные чистой тряпкой(больше клеток,чем при отпечатке)-при ОРВИ.При бактериальных инфекциях лучше взятие отпечатков или исследование срезов.

Ход исследования:

-сухую люминесцентную сыворотку растворить в объеме согласно инструкции на ампуле дистиллированной водой

-желательно сыворотку отцентрифугировавть при 3-6 тыс оборотах в мин-30 мин.Разведенную сыворотку можно длительное время хранить в пробирке с резиновой пробкой при температуре 4-10 градС

-непосредственно перед нанесением ее необходимо развести 0,15 М хлористым натрием(рН 7,2-7,4),рабочие разведения готовят рядом двухкратных разведений

-на срез наносится несколько капель сыворотки(окраска производится во влажной камере-чашке Петри,на дно которой наносится увлажненная фильтровальная бумага

-15-30 мин при комнатной температуре

-промыть мазок в 0,15 М хлористом натрии дважды по 10 мин

-мазок подсушить на воздухе

 Мазки просматриваются под водной или масляной иммерсией используя специальное нефлюоресцирующее масло или его заменитель,например,диметилфталат.

РЕЗУЛЬТАТЫ: фон темный, некротические клетки и ткани-темно-желтые,участки,содержащие антиген-темно-зеленые.

Применение тканей,залитых в парафин,дает неспецифическую флюоресценцию.Поэтому необходима специальная заливка тканей по методике Санта-Мари.

 

Заливка в парафин по Санта-Мари:

-фиксация кусочков толщиной до 5 мм в 96% этаноле,охлажденном до 4 град С(50 мл на 1 кус) в закрытом сосуде 1 час при 4 град

-подрезание ткани до толщины 2-4 мм

-продолжение фиксации при 4 град С 15-24 часа

-абсолютный этанол при 4 град С 1-2 часа(четырежды)

-ксилол при 4 град С 1-2 часа-трижды,после чего оставить материал при комнатной температуре

-парафин при 56 град С по 1-2 часа(четырежды)

-резка обычнм способом только флотация на поверпхности воды при 40 град С и кратковременнная.Срезы высушить при 37 град 30 мин(срезы можно хранить при 2 град С до нескольких недель

-депарафинирование в холодном ксилоле при 4 град С по 10-15 сек(дважды)

-удаление ксилола осторожным движением вверх-вниз в 96 % этаноле при 4 град С по 10-15 сек(трижды)

-удаление спирта в буферном растворе при 4 град С по 1 мин-трижды

-обработка флюоресцентной сывороткой.

  

12  Методы выявления геликобактеров(Л.И.Аруин.Хронический гастрит.Амстердам,1993,с.298)

 12а    Метод Вартин-Старри

Фиксация в 10% формалине,проводка парафин.

Приготовление растворов:

1.Подкисленная вода-трижды дистиллированной воды 1000 мл  лимонной кислоты                          10 г

2.Раствор нитрата серебра:нитрат серебра 2,0 г                       подкисленная вода  100,0 мл  Для приготовления 1%-го раствора добавить равный объем подкисленной воды

3.Раствор гидрохинона:гидрохимнон 0,15г                           подкисленная вода  100 мл

4.Раствор желатина:особо чистый желатин 10,0 г               подкисленная вода- 200 мл

5.Проявитель:                           2% раствор нитрата серебра-1,5 мл

                                                 5% раствор желатина          -3,75 мл

                                          0,15% раствор гидрохинона        -2,0 мл

    

растворы подогреть до 50-60 град.С,смешать в указанном порядке,использовать немедленно

 Окраска:

1.Депарафинированные срезы довести до подкисленной воды

2.1% раствор нитрата серебра при 55-60 град.С-30 мин.

3.Проявитель-3-5 мин(срезы ставновятся коричневыми)

4.Промыть в теплой воде(55-60 град),затем в дистиллированной воде

5.Обезвоживание,просветление,бальзам.

РЕЗУЛЬТАТЫ:Геликобактеры черные,хорошо видна их изогнутая форма,фон-желтовыатый или кориневый

 

12б 2-й метод Вартин-Старри

1.Депарафинированные срезы помещают в раствор,содержащий 20,0 мл 5 г на л азотнокислого серебра в ацетатном буфере рН 4 и облучают 1 мин микроволновым  процессором.

2.Без отмывания срезы переносят в свежеприготовленный проявитель(10 20 г на литр азотнокислого серебра + 50 г желатины+14 мл 1,5 г на литр гидрохинона в ацетатном буфере в ацетатном буфере при рН 4 при 60 град.С,промывают в ацетатном буфере при 60 град.и в дистиллированной воде       

3.Фиксируют в 30г на литр тиосульфата натрия

4.Промывают,фиксируют,обезвоживают,заключают в бользам

РЕЗУЛЬТАТЫ: геликобактеры окрашиваются в черный цвет

 12в Метод Гимзы:

Растворы:

1  Основной раствор:Краска Гимзы-1,0г,глицерин-54 мл,спирт 96%-84 мл(профильтровать)

2.Рабочий раствор:основной раствор-1,0 мл,дистилл.вода -38,0 мл,0,1% раствор углекислого калия-2,0 мл

 ОКРАШИВАНИЕ:

1.Депарафинированные срезы в дистилл.воду на 10-15 мин

2.Рабочий раствор 20 мин

3.Промывка в дистиллир.воде.Обезвоживание,просветление,бальзам

РЕЗУЛЬТАТЫ: геликобактеры окрашиваются в синий цвет

 

12г    Метод с карболовым фуксином

Реактивы: Основной фуксин 0,4 г+фенол кристалл. 2,0 г,+абсолютный спирт 4,0 мл,+дистилл.воды 100,0 мл

Окрашивание:

1.Депарафинированные срезы в краситель на 5 мин

2.Ппромыть в проточной воде

3.Промыть в ацетоне

Срезы можно не заключать и просматривать под иммерсией

РЕЗУЛЬТАТЫ: геликобактеры темно-красные

  

12д Окраска толуидиновым синим

Реактивы:

Натрия ацетат 1,943 г,натрия барбитурат 2,943 г,дистиллированной воды до 100 мл(основной раствор)

К 10 мл основного раствора добавить 22 мл М:10 раствора соляной кислоты, 18 мл дистиллированной воды и 1 мл 1%-го толуидинового синего О

А-двуосновной ацетат натрия(№ НСО  )-9,465 г   дистиллир.воды до 1 л

Б-кислый фосфат калия(КН РО  )-9,08  дистиллированой воды до 1 л

К 25 мл раствора А добавить 25 мл раствора Б и 1 мл 1% толуидинового синего.

Продолжительность окрашивания 10-15 мин

РЕЗУЛЬТАТЫ: геликобактеры и ядра клеток в т.ч.,ПМЯ лейкоцитов окрашиваются в темно-синий цвет,фон слабый.

  

13   Окраска грибковой флоры(приведено по О.К Хмельницкому. Гистологическая диагностика поверхностных и глубоких микрозов.Ленинград,М.1973

 

13а.Окраска по Гомори-Гроккоту в модификации В.С.Лесового(с.31)

-депарафинирование срезов

-5% трехокись хрома  30 мин при 37-40 град.С

-проточная вода 10 мин

-1% бисульфит натрия 1 мин

-проточная вода 5 мин

-3 смены дистиллированной воды по 2 мин в каждой

-импрегнация в растворе уротропин-серебра 30 мин при 56-58 град С

-3 смены дистиллированной воды по 2 мин каждая

-отбеливание в 1% растворе хлорамина или хлорной извести или НС1 10 мин под микроскопом или в разведенной пополам перекиси водорода

-докраска 0,05% растворе пикриновой кислоты в 70% спирте в течение 1 мин

-2% раствор гипосульфита натрия-2-5 мин

-проточная вода 5 мин

-обезвоживание,просветление,бальзам

 ПРИГОТОВЛЕНИЕ уротропин-серебра:5 мл 5%-го раствора азотнокислого серебра смешивают с 3% раствором уротропина.Сначала образуется белый осадок,который исчезает при помешивании.Раствор становится прозрачным и бесцветным.Может сохраняться в течение 2-х недель при комнатной температуре  и месяц в холодильнике

РЕЗУЛЬТАТ:грибы коричневого или черного цвета,фон бледно-желтый или бесцветный.

При этой методике коллагеновые волокна окрашиваются в коричневый,ретикулиновые-в черный цвет,при перекраске эритроциты могут стать темно-коричневыми и симулировать клетки грибов.

 

13б Окраска грибов по Граму-Вейгерту

-парафиновые срезы до воды

-окраска кристаллвиолетом по Хукеру и Конну-30 секунд(краска годна 2-3 года)

Готовят:2 г кристалл.фиолетового,+20 мл 96 % спирта,+800 мг щавелево-кислого аммония,80 мл дистиллированной воды

-окунуть в воду-обработать йодом по Вейгерту 20-30 сек(2 г йодистого калия растворить в 2-3 мл дистиллированной воды.Затем добавить 1,0 г кристаллического йода,долить до 100 мл)

-дифференцировать в ацетоне 10-15 сек

-промыть в воде

-докрасить 0,5% водным сафранином 30 сек

-дифференцировать и обезводить в ацетоне,добавляя его по каплям -10-15 сек

-просветлить в смеси ацетона с ксилолом,двух сменах ксилола.Заключить в полистирол?

 РЕЗУЛЬТАТЫ: грамположительные грибы сине-черные,грамотрицательные и фибрин-красного цвета,цитоплазма-розовая

 

13в.Окраска по А.А.Боголепову (с.25)

-срезы окрашивают в свежеприготовленном водном растворе эозина 2-3 мин(насыщенный спиртовый раствор эозина 5 мл,вода дистил.95 мл)

-слить краску,не споласкивая в воде,просушивают фильтровальной бумагой

-окрашивают карболовым генциановым фиолетовым(через фильтровальную бумагу) 5 мин(раствор готовят из расчета 5 капель насыщенного спиртового раствора краски на

1 мл 2,5% карболовой воды.Краска годна после суточного стояния не более 6 суток)

-р-р Люголя 2-3 мин,обсушивание фильтровальной бумагой,дифференцировка в анилин-ксилоле(готовят из расчета:1 часть анилинового масла,2 части ксилола)

-ксилол, бальзам

 РЕЗУЛЬТАТЫ: грамположительные грибы окрашиваются в темно-синий цвет. Грибы должны быть "свежими"(их гибель ухудшает качество окрашивания)

 

Лучшие результаты дает окраска по Граму, применяя не кармин, а сновной фуксин,приготовленный Гудпастуру.

 

13г.Окраска по Граму с красителем Гудпастура(методика,предложенная Мак-Коллюмом)

-окрашиваются срезы 10-30 мин в красителе Гудпастура(фуксин основной 0,59 г,аналин 1 мл,фенол кристаллический 1 г,спирт 30% 100 мл) и затем промывают водой.

-обрабатываются в крепком формалине в течение нескольких секунд(до появления розового цвета вместо красного),после чего снова промывают в воде.

-окрашивают в насыщенном растворе пикриновой кислоты в течение 2-5 минут,пока срезы не примут фиолетово-желтый цвета и снова промывают в воде.

-дифференцируют в 96% спирте(до восстановления красного цвета),опять промывают в воде.

-окрашивают в растворе кристаллического фиолетового или генцианового фиолетового в течение 5 минут(краски 5 г,абсолютный спирт 10 мл,аналин 2 мл,вода 88 мл),промывают в воде.

-погружают в йодистый раствор Грама на 1 мин(1 г йода кристалл,йодистого калия 2 г,дистилл.воды 300 мл)

-высушивают фильтровальной бумагой

-обрабатывают в равных частях анилина и ксилола до прекращения изменения цвета

-промывают 2 раза ксилолом и заключают в бальзам.

РЕЗУЛЬТАТЫ-грамположительные элементы гриба окрашиваются в голубой цвет,грамотрицательные-в красный.Тканевые элементы-от красного до пурпурного.

Общий недостаток этих окрасок-неспецифическое прокрашивание тканей,которые могут быть приняты за грибы.Хорошо красятся молодые формы грибов,отмирающие плохо.

Плесневые не окрашиваются вообще.

 

Следующие методы лишены указанных недостатков.

13д Окраска по Брауну-Брен в модификации Хмельницкого

-срезы окрашивают железным гематоксилином Вейгерта в течение 2-4 мин,после чего ополаскивают вследствие из-за обильного отхождения краски

-дифференцируют в 1% растворе соляной кислоты и помещают в воду на 3 мин

-окрашивают карболовым генциановым фиолетовым 5-10 мин( в маленькой бутылочке смешивают 5 капель 5% бикарбоната настрия,содержащего,соедержащего 0,5% фенола для предотвращения гниения с 0,75 1% водного р-ра генцианового фиолетового,который смывают водой)

-красят срезы раствором Люголя 1 мин,после чего обмывают спиртом и дифференцируют срез в растворе анилина со спиртом(1 часть анилинового масла и 1 часть 96% спирта),пока не перестанет отходить краска

-смывают раствор анилина 96% спиртом и промывают срез в воде

-окрашивают очень быстро освновным фкусином(5 мл насыщенного спиртового р-ра основного фуксина на 100 мл дистиллированной воды),смывают 96% спиртом и дифференцируют 1% спиртовым р-ром пикриновой кислоты до тех пор,пока не перестанет отходить краска

-переносят последовательно срез в 96% спирт,в смесь 96: спирта с ксилолом(пополам),затем в чистый ксилол,после чего заключают в бальзам

РЕЗУЛЬТАТЫ:ядра клеток окрашиваются в черно-коричневый цвет,цитроплазма-

в желтый,Грамположительные грибы окрашиваются в сине-лиловый,грамотрицательные-

в красно-лиловый.

 

Достаточно хорошо выявляются грибы по методу Шабадаша в модификации Цинзерлинга(см ШИК-реакцию)

 

13е Более достоверно выявляются грибы методом Гридли

-срезы опускаются на 1 час в 4% хромовую кислоту,после чего промываются 5 мин в проточной воде

-погружают в реактив Фельгена,приготовленный по Колеману(раствор 1 г основного фуксина в 200 мл кипяченой воды),отфильтровывают и прибавляют 2 г метабисульфита калия и 10 мл нормального раствора соляной кислоты.Дают обесцветиться сутки,затем прибавляют 0,5 г активированного угля,встряхивают и фильтруют через бумагу.Р-р должен быть бесцветным

-ополаскивают в сернистой кислоте три раза по 2 мин(10% метабисульфит настрия 6 мл,нормальной серной к-ты 5 мл,дистиллированной воды 100 мл) и после этого промывают в проточной воде

-кладут срезы на 15-20 минут в альдегидно-фуксиновый раствор(фуксин основной 1 г,70% спирт 200 г,паральдегид 2 мл,соляная кислота 2 мл.Приготовленный р-р зреет три дня и должен быть синего цвета

-смывают избыток краски 96% спиртом и промывают срезы в воде

-подкрашивают метанилом желтым в течение 2-5 мин(метанил желтый 0,25 г,ледяная уксусная к-та 0,25 г,дистиллир.вода 100 мл)

-промывают срезы в воде,обезвоживают и заключают в бальзам

РЕЗУЛЬТАТЫ: нити темно-голубые,споры от темно-розового до пурпурного,общий фон желтый.МЕТАНИЛ ЖЕЛТЫЙ МОЖНО ЗАМЕНИТЬ ПИКРИНОВОЙ КИСЛОТОЙ

(срезы красятся 1 минуту в 0,05% растворе ее в 70% спирте)

Последние 2 метода позволяют выявить и молодые,и старые формы грибов.Параллельно

необходимо красить срезы гематоксилином и эозином)т.к неспецифически окрашиваются тканевые струткры,имитируя грибы.

 

13ж Метод сульфатирования.

Позволяет выявить очень молодые формы грибов,не всегда обнаруживаемые другими методами(напр,кокцидиоидоз)

-срезы после удаления парафина помещают в абсолютный спирт на 5 минут и высушивают в воздухе 5 минут.

-помещают в сульфатирующий реактив на 5 минут

-срезы кладут на 3 мин в 3% уксусную кислоту и окрашивают 0,01% раствором толуидинового синего в 3% уксусной кислоте 5 мин

-просмывание в 3% уксусной кислоте 1 мин

-помещают срезы последовательно на 1 мин в 96 спирт,ксилол,полистирол

СУЛЬФАТИРУЮЩИЙ РЕАКТИВ получается при смешивании один к одному концентрированной серной кислоты с предварительно замороженным диэтиловым эфиром.Серная кислота также должна быть охлаждена