Гемагглютинирующие свойства (фитагглютинины) экстрактов из семян семейства бобовых (Сообщение I)

Все известные методы изготовления гемагглютинирующих сывороток, за исключением нормальных (изоагглютинирующих) а и р, являются сложными, дорогостоящими и трудоемкими. Кроме того, некоторые из этих методов настолько малоэффективны, что в практике серологического производства экономически не оправдываются.

Изучение гемагглютинирующих свойств экстрактов из семян семейства бобовых показало, что в настоящее время появился новый источник получения специфичных гемагглютинирующих препаратов.

Сведения о том, что экстракты из веществ растительного происхождения могут агглютинировать эритроциты, имеются давно. Штильмарк (Н. Stillmark) в диссертации, опубликованной в Юрьеве в 1888 г., т. е. за 13 лет до открытия изогемагглютинации и за 14 лет до получения гетероиммунных сывороток анти-А и анти-В, описал опыты, в которых под влиянием белковых веществ из семян рицина эритроциты разных животных соединялись в конгломераты. В 1917 г. отечественные авторы О.Г. Биргер и И.Л. Кричевский установили присутствие гематтлютининов в листьях растения Cotyledon scheideckeri. Однако им не удалось выявить избирательного действия этих фитагглютининов в отношении Эритроцитов различных животных.

Первые сведения о неполных фитагглютининах также задолго предшествовали открытию неполных иммунных антител. В 1909 г. Мисснер и Ревальд (Miessner и Rehwald) наблюдали агглютинацию эритроцитов рогатого скота при действии значительно разведенного рицина лишь после прибавления сыворотки рогатого скота.- Существование иммунных неполных антител (к антигенам системы резус) впервые доказали Винер й Рейс (A. Wiener и R. Race) только в 1944 г.

В последующий период, охватывающий более 50 лет, не было проведено фундаментальных исследований, намечавших новые пути изучения антител растительного происхождения. Однако в 1943 г. Ландштейнер (К. Landsteiner) высказал сожаление, что растительные агглютинины, которые в литературе обозначаются как неспецифические, не привлекают достаточного внимания, несмотря на их теоретический интерес.

В 1948 г. Ренконен (К- Renkonen) сделал открытие, которое послужило началом нового этапа изучения растительных антител. Исследуя экстракты из семян 99 видов растений, он установил, что 6 из них агглютинируют эритроциты крови человека в соответствии с групповой принадлежностью к системе АВО(Н). В 66 экстрактах не содержалось агглютининов. Некоторые экстракты действовали на эритроциты вне зависимости от наличия тех или иных агглютиногенов, т. е. обладали свойством панагглютинабильности.

В монографии Рейса и Сэнджер (R. Race и R. Sanger) имеется указание на то, что независимо от Ренконена в 1949 г. Бойд и Регуера (W. Boyd и R. Reguera) также открыли несколько специфичных экстрактов анти-А.

Позднее Бойд для обозначения природных растительных антител предложил термин «лектин» (от латинского legere), которым в настоящее время пользуются наряду с термином «фитагглютинин».

Работы Ренконена, Бойда и Регуера явились стимулом к поискам новых специфичных фитагглютининов и изучению их свойств. Было установлено, что фитагглютинины могут быть специфичными не только для агглютиногенов Н, А и В, но и по отношению к фактору N человека [Левин (P. Levine) и др.]; могут быть неполными, проявляя свое действие в макромолекулярной среде или в пробе Кумбса [Крюпе (М. Krupe) и др.]; дают возможность выявлять различные формы групп А в эритроцитах [Бойд и Шапли, Берд (W. Boyd и Е. Shapleigh, G. Bird)]; могут быть с успехом применены при определении групп крови для клинических, судебномедицинских, а также для некоторых учебных целей [Крюпе, Бойд и Шапли, Берд, Каль, Маккерле (Kah!. Mackerle)]; могут быть применены для определения агглютиногена Н в пятнах крови реакцией абсорбции агглютининов [Петтенкофер (Petten- kofer)] и агглютиногенов А и В в очищенных субстанциях групп крови реакцией задержки гемагглютинации (Крюпе); помогают устанавливать связь между антигенами разных групп крови, (Берд, Бойд и Шапли); лектины некоторых растений агглютинируют- эритроциты преимущественно некоторых видов животных (Крюпе и др.).

Поскольку новый вид препаратов из семян растений, содержащих специфичные агглютинины к агглютиногенам Н, А и В, может иметь существенное значение для судебномедицинской экспертизы, мы провели в 1958—1959 гг. ряд опытов по исследованию агглютинационных свойств экстрактов из зрелых семян растений семейства бобовых. Семена, присланные из ботанических садов СССР, хранились в пакетах при комнатной температуре. Исследовались в основном те виды растений, в которых, судя по литературным данным, можно было ожидать обнаружение тех или иных лектинов. Всего было исследовано 30 образцов семян от 21 вида растений.

Сухие семена размалывали в ступке и просеивали через сито для получения тонкой однородной муки. Экстрагировали 1 г муки в плоскодонной колбе 10 мл стерильного физиологического раствора с pH = 7 (первые 2 часа при 37°, а последующие 18—20 часов при 7°). Жидкость центрифугировали, фильтровали через обеззоленный бумажный фильтр и сохраняли при 7° в закрытой пробирке без добавления антибактериальных веществ.

Агглютинационную способность каждого экстракта испытывали несколькими образцами эритроцитов О, А и В путем титрования. Экстракт разводили физиологическим раствором в 2, 4, 8 раз и т. д. так, чтобы в каждой пробирке оставалось по 3 капли жидкости. После добавления во все пробирки по капле 2% взвеси стандартных эритро^ цитов с известной групповой характеристикой в отношении изосероло- гических систем АВО(Н), MN и Rh смесь оставляли на 1! /г часа при разных температурных режимах: 3—7°, 20° и 37°, центрифугировали в течение 1 минуты при 1000—1500 оборотов и встряхивали в штативе. Результаты реакции агглютинации наблюдали невооруженным глазом и под микроскопом (на предметных стеклах под покровными).

Большинство готовых экстрактов представляло собой жидкость, похожую на сыворотку, несколько опалесцирующую, обычно светлого желтовато-зеленоватого цвета с pH = 5—6.

Экстракты из семян Cytisus elongatus Waldst. et Kit., Evonymus europaeus L., Lathyrus silvester L., Phaseolus vulgaris L., Robinia pseudoacacia L., Ulex europaeus L., Vicia cracca L., Vicia sativa L., Vicia tetra- sperma Mnch. агглютинировали эритроциты групп О, А и В. В зависимости от вида растения и температурного режима реакции титр агглютининов варьировал от 1:8 до 1:2048. Следует отметить, что наиболее высокие показатели титра наблюдались при 7°. В четырех экстрактах имело место различие между величинами титра по отношению к эритроцитам групп О, А и В. Изготовить препарат, специфично реагирующий с эритроцитами какой-либо одной группы или с агглютиногеном Н, путем разведения экстракта не удалось. Из сем'лн четырех видов растений— Laburnum anagyroides L. (Сухумский ботанический сад, год сбора неизвестен), Cytisus ruthenicus Fisch. (Главный ботанический сад АН СССР, Москва, год сбора неизвестен), Lotus tetragonolobus L. (Ташкентский ботанический сад, сбор 1956 г.), Cytisus sessilifolius L. (Никитский ботанический сад, сбор 1956 г.)—были получены экстракты, содержащие фитагглютинин (лектин) анти-Н.

Эти экстракты агглютинировали эритроциты группы О и эритроциты групп А,-В и АВ, содержащие агглютиноген Н; они являлись специфичными, т.е. в неразведенном виде не реагировали с эритроцитами групп А и АВ, в которых агглютиноген Н не обнаруживался гетеро- иммунной сывороткой анти-Н (таких эритроцитов групп В мы не имели). Титр агглютинина анти-Н, определяемый по эритроцитам группы О, оказывался наивысшим при температурном режиме реакции агглютинации 7° и был равен 1:4 (Laburnum anagyroides L.), 1:16 (Cytisus ruthenicus Fisch.), 1:32 (Lotus tetragonolobus L.), 1:256 (Cytisus sessilifolius L.).

В качестве примера приводим действие экстракта из семян Lotus tetragonolobus L. при 20° (та бл. 1.).

Экстракт, изолированно агглютинирующий эритроциты группы А (лектин анти- А), был получен из семян Dolichos biflorus L. и Phaseolus lunatus (limensis) L. Семена Dolichos biflorus L. собраны в 1933 г. в Сухуми (происхождение — Индия). Семена Phaseolus lunatus L. были представлены двумя образцами: 1) белосеменная фасоль, собранная в 1956 г. в Северной Осетии (происхождение — США), 2) краснопестрая фасоль, собранная в 1953 г. в Ташкенте (происхождение — Краснодарский край).

Таблица 1

Агглютинация эритроцитов разных групп экстрактом анти-Н из семян Lotus tetragonolobus L.

Экстракт семян Dolichos biflorus L. содержал строго специфичный лектин анти-А. Титр его колебался от 1:8 до 1:128 в зависимости от степени выраженности агглютиногена А. При титровании экстракта в сыворотке группы АВ титр агглютинина повышался до 1:512. Температура в диапазоне 7—20° не оказывала влияния на титр лектина, но при 37° ти тр уменьшался в 8 раз.

Следует отметить, что Бойд и Шапли сочли лектин из семян Dolichos biflorus L. специфичным для эритроцитов группы А с выраженным агглютиногеном; агглютинации эритроцитов группы А со слабым агглютиногеном эти авторы не наблюдали. Расхождение наших данных с данными Бойда и Шапли можно объяснить либо исследованием семян с разными свойствами, либо различием в методе учета реакции агглютинации (агглютинация эритроцитов со слабым агглютиногеном А нами наблюдалась только под микроскопом).

Неразведенный экстракт лимской фасоли агглютинировал эритроциты групп А, В и АВ и не агглютинировал эритроциты группы О. Таким образом, этот экстракт содержал лектины анти-А и анти-В или их комплекс анти-A+B. Проведение реакции при разной температуре позволило установить, что температурные оптимумы ее с эритроцитами групп А и В различны (табл. 2).

Разведение экстракта в 8 раз и осуществление реакции при 37° дало возможность получить строго специфичный лектин анти-А с титром 1 : 512. После дальнейшего разведения экстракта в 10 раз титр был равен 1:32. Таким образом, из 1 г семян лимских бобов можно получить не менее 500 мл экстракта с титром агглютинина анти-А 1:32.

Таблица 2

Влияние температуры на агглютинационную способность экстракта из лимской белосеменной фасоли

Специфичный лектин анти-В был обнаружен в экстрактах из семян Coronilla varia L. и Sophora japonica L.

Исследованы два образца семян Coronilla varia L. — из округа Никитского ботанического сада (сбор 1959 г.) и из Главного ботанического сада АН СССР (Москва, сбор 1957 или 1958 г.). По своим агглю- тинационным свойствам эти экстракты существенно отличались друг от друга. Экстракт из семян Никитского ботанического сада не агглютинировал эритроциты групп О и А и имел титр лектина анти-В 1: 512 при 7 и 20°. В условиях 37° агглютинационная способность значительно понижалась. При определении титра лектина анти-В отмечалась зона ослабления агглютинации (от неразведенного экстракта до разведения в 4 раза). Разведение в 4 раза уничтожало эту зону, вызывая соответствующее уменьшение титра до 1:64.

В экстрактах из семян, присланных из Главного ботанического сада АН СССР, при всех температурных режимах полных (солевых) агглютининов к агглютиногенам системы АВО(Н) не найдено. Однако при разведении экстракта сывороткой крови АВ были выявлены лектины анти-А и анти-В или их комплекс анти-A + B с титром 1 :256; агглютинации эритроцитов группы О по-прежнему не происходило.

Экстракты из четырех образцов Sophora japonica L. проявили неодинаковое действие.

Экстракт из семян, собранных в Ташкентском ботаническом саду в 1957 г., реагировал весьма своеобразно. В неразведенном виде и в небольших разведениях он либо не агглютинировал, либо слабо агглютинировал эритроциты О, А и В. При дальнейшем разведении устранялась реакция агглютинации с эритроцитами О и А и значительно нарастала способность агглютинировать эритроциты В, причем титр лектина анти-В оказывался равным 1:2048 (при 7, 20 и 37°). Зона задержки и ослабления агглютинации (прозона) могла быть уничтожена путем разведения экстракта физиологическим раствором (табл. 3).

Экстракт из семян, присланных из Сочинского дендрария (сбор 1957 г.), обладал аналогичными свойствами, но был совершенно специфичным, так как не агглютинировал эритроциты О и А. Кроме того, температура 37° неблагоприятно отражалась на агглютинирующей способности.

Агглютинин анти-В в экстракте из семян, собранных на Кубани в 1952 г., отличался более слабой агглютинирующей способностью и большей величиной зоны полной задержки агглютинации (от неразведенного экстракта до разведения 1:4—1:8).

Семена, собранные в 1958 г. в Никитском ботаническом саду, не содержали полных агглютининов.

Таблица 3

Влияние предварительного разведения экстракта из семян Sophora japonica L. на прозону и титр лектина анти-В (реакция при 7°)

Таким образом, был получен эффективно действующий агглютинин анти-В из семян двух видов растений. Следует отметить сообщения ряда авторов [Маккерле и Опавски, О. Мякеля, П. Мякеля, (S. Mackerle и J. Qpavsky, О. Makeia, P. Makela)] о том, что специфичный фитагглю- тинин анти-В с высоким титром еще не найден.

Хранение экстрактов в течение 3 недель при температуре 7° и отсутствии бактериального и грибкового загрязнения почти не отражалось на титре лектинов.

Мы не выявили полных фитагглютининов в экстрактах из семян: Lotus corniculatus L., Cytisus nigricans L., Genista tinctoria L., Cichorium inihybus L.

Лектины в семенах сохраняются длительный промежуток времени. Штильмарк выявил сильные агглютинины в семенах 30-летней давности, Крюпе—в семенах 25-летней давности. Нами был обнаружен специфичный агглютинин анти-А в семенах Dolichos biflorus L., собранных 26 лет назад.

Факт существования фитагглютининов представляет значительный теоретический и практический интерес для биологии и медицины вообще н для судебной медицины, в частности.

Литературные сведения и результаты наших опытов позволяют считать, что при дальнейшей разработке вопроса фитагглютинины сыграют большую роль в судебномедицинской практике для определения групповой принадлежности крови и других биологических объектов.

Мы продолжаем исследования в этом направлении.

Выводы

1. Экстракты из семян некоторых растений семейства бобовых обладают способностью агглютинировать эритроциты человека.
2. По особенностям своего действия исследованные нами экстракты могут быть распределены на три группы: а) содержащие фитагглютинины (лектины) анти-Н, анти-А и анти-В или их комплекс анти-H+A+B; б) имеющие два фитагглютинина — анти-А и анти-В или комплекс анти-А+В; в) имеющие один фитагглютинин — анти-Н, анти-А или анти-В; такие экстракты специфичны.
3. Оптимум действия большинства фитагглютининов зависит от температурного режима реакции агглютинации. В то же время активность некоторых фитагглютининов остается одинаковой при изменении температуры от 7 до 37°.
4. Экстракты из семян некоторых растений, содержащие несколько агглютининов или их комплексы, можно сделать специфичными двумя путями: а) при значительном различии в высоте титра агглютининов нежелательное действие агглютининов с низким титром может быть устранено путем разведения экстракта физиологическим раствором; б) при наличии агглютининов с различным температурным оптимумом действия имеется возможность подавить активность того или иного агглютинина путем выбора соответствующего температурного режима реакции агглютинации.
5. Территориальные условий произрастания растений оказывают большое влияние на наличие и свойства фитагглютининов в семенах.
6. Использование экстрактов из семян в качестве гемагглютинирующих препаратов является более экономичным, чем применение дорогостоящих иммунных сывороток.