Гистохимические изменения некоторых дегидрогеназ и НАД-диафоразы в экспериментальных повреждениях различной давности

Для установления прижизненности и давности повреждений мы исследовали ряд дегидрогеназ, принимающих участие в обмене веществ и отражающих уровень энергетических процессов в клетках. В настоящей статье приводятся результаты исследования сукцинатдегидрогеназы (СДГ), лактатдегидрогеназы (ЛДГ), малатдегидрогеназы (МДГ), α-глицерофосфатдегидрогеназы (α-ГФДГ) и НАД-диафоразы.

Эксперименты проводили на белых крысах массой 150—250 г. Подопытным животным в области головы, спины и бедра наносили резаные раны, проникающие до мышц, длиной 1—1,5 см. По истечении 30 мин, 1, 2, 4, 8, 16, 24, 48 ч животных декапитировали. Из краев ран иссекали кусочки размером 0,5X1,0 см и на криостат-ных срезах изучали перечисленные ферменты. В качестве контроля использовали кожу и мышцы с неповрежденных участков противоположной стороны. Посмертные изменения изучали в те же сроки после нанесения ран на трупах животных (трупы хранили при комнатной температуре). Ферменты определяли по методикам М. Нахласа и соавт. (1958) и Р. Гесс и соавт. (1958), описанным в руководствах Э. Пирса (1962), М. Берстона (1965) и Р. Лилли (1969). В качестве акцепторов водорода использовался нитросиний тетразолий (нитро-СТ), а в качестве субстрата — соответствующие соли сукцинат-, малат-, лактат и α-глицерофосфат натрия. Кофакторами (за исключением СДГ) служили НАД и НАДФ. Изучение и фотографирование объектов проводили с помощью микроскопа МБИ-6, а измерение — с помощью микрометра АМ-9-2.

Установлено, что дегидрогеназной активностью в той или иной степени обладают все основные структурные единицы кожи и подкожной клетчатки, за исключением соединительнотканных волокон, рогового слоя эпидермиса и тучных клеток. Среди исследованных дегидрогеназ наиболее высокую активность в тканях кожи проявили СДГ и ЛДГ, меньшую — МДГ и еще более слабую — α-ГФДГ.

Высокая активность (++++) дегидрогеназ и НАД-диафоразы отмечена в эпидермисе кожи с убывающей интенсивностью от базального слоя к роговому, в клетках влагалища корня волос с убывающей интенсивностью от росткового слоя к центру, в клетках сальных желез и в мышечных волокнах, поднимающих волос. В стенках кровеносных сосудов, нервных волокнах, в клетках соединительной ткани собственно кожи и подкожной клетчатки обнаружена умеренная (+ +) активность ферментов. В мышечных волокнах активность ферментов выявляется по ходу миофибрилл в виде мелких зерен диформазана, цвет которых варьирует от светло-голубого (α-ГФДГ) до темно-синего (СДГ) в зависимости от активности фермента. Как подкожные, так и скелетные мышечные волокна, расположенные в одних и тех же участках, проявляют различную дегидрогеназную активность. Подсчет количества волокон в 10 полях зрения показал, что около 7—12% волокон обладают высокой ферментативной активностью, 58—75% — умеренной и 15—35% — слабой. Подкожные мышечные волокна в целом проявляют более высокую активность фермента, чем волокна скелетных мышц. Разная степень активности фермента в мышечных волокнах, по-видимому, зависит от их функционального состояния.

В повреждениях 30-минутной давности в эпидермисе и собственно коже существенных сдвигов не происходит. Более заметные изменения были обнаружены во всех опытах в области повреждения мышечной ткани, особенно подкожной. По краю разреза на участке шириной 50—150 мкм наблюдается увеличение интенсивности окраски мышечных волокон, создающее впечатление повышенной активности дегидрогеназ. Однако при большем увеличении микроскопа видно, что усиление интенсивности окраски обусловлено увеличением размера зерен диформазана с образованием «натеков» и бесформенных конгломератов (рис. 1, см. вклейку). Это, по-видимому, вызвано набуханием митохондрий, которое является одним из наиболее ранних признаков повреждения клетки.

Чтобы установить наступление указанных изменений в более ранние сроки повреждений, мы поставили серию опытов с давностью повреждений от 10 до 20 мин. При этом также обнаружено укрупнение зерен диформазана по ходу миофибрилл. Полученные результаты не противоречат данным литературы (И.А. Алов и соавт., 1969, и др.).

Значительное снижение активности ферментов по краю раны в собственно коже наблюдается в повреждениях одночасовой давности и становится более выраженным к 4 ч. По мере увеличения срока прижизненного повреждения активность ферментов постепенно снижается, в повреждениях 4-часовой давности зона с пониженной ферментативной активностью имеет ширину 100—250 мкм от края раны. За пределами указанной зоны происходит постепенное повышение активности ферментов, на расстоянии 400—500 мкм от края раны она становится выше нормы. В эпидермисе снижение активности ферментов наблюдается на участке шириной не более 100 мкм, а дальше она заметно повышается, особенно в клетках базального слоя. Постепенное возрастание активности ферментов отмечается и в клетках рыхлой соединительной ткани подкожной клетчатки, к 4 ч оно становится хорошо выраженным.

Более значительные изменения по сравнению с таковыми в повреждениях 30-минутной давности наблюдаются и в мышечных волокнах. В них увеличивается количество деформированных, крупнозернистых и «тающих» волокон (рис. 2, см. вклейку). Указанные сдвиги отмечались на участке шириной до 200 мкм от края раны, в некоторых опытах они обнаруживались на большем протяжении. За пределами этой зоны происходит резкое возрастание активности ферментов в мышцах, что нередко выявляется на всем срезе.

В ранах 4-часовой давности по краю разреза в пределах вышеуказанной зоны мышечные волокна теряют активность ферментов и некротизируются (рис. 3, см. вклейку).

В повреждениях 8- и 16-часовой давности наступает полное отграничение зоны некроза не только в мышечной ткани, но и в собственно коже с потерей волокнистой структуры соединительной ткани. В собственно коже ширина зоны некроза составляет 100—200 мкм. За этой зоной находится вторая зона шириной от 100 до 200 мкм с повышенной ферментативной активностью во всех слоях кожи и подкожной клетчатки (рис. 4, см. вклейку). В сосочковом слое кожи, особенно в ее субэпи-дермальной части, увеличивается количество соединительнотканных клеточных элементов и мелких кровеносных сосудов с высокой активностью фермента. В зоне высокой активности фермента в собственно коже идентифицировать какую-либо клеточную структуру, за счет которой происходит повышение активности фермента, не представляется возможным. Создается впечатление «сгущения» соединительнотканных волокон, в которых откладываются синие зерна диформазана. В подкожной клетчатке эта зона более выражена, окраска ее интенсивнее, структура зернистая, однако в ней также трудно определить клеточные элементы.

В ранах 24- и 48-часовой давности признаки границы между живой и мертвой тканью проявляются более четко. Наблюдается дальнейшая активация ферментов в клеточных элементах рыхлой соединительной ткани подкожной клетчатки. Увеличивается количество капилляров и мелких кровеносных сосудов с высокой активностью дегидрогеназ.

Изучение посмертных ран показало, что в течение первых 4 ч не наблюдается каких-либо изменений в локализации, активности, мозаичности и гистохимической структуре ферментов. После 4 ч отмечается тенденция к снижению активности ферментов, заметно увеличивается размер зерен формазана. В ранах 8-часовой давности хорошо видны изменения локализации и размеров гранул. Значительная часть гранул резко увеличена в объеме, располагается хаотично, местами сливаясь в крупные конгломераты. Через 16 ч происходит дальнейшее углубление описанных изменений, вплоть до гомогенизации, которая достигает максимума к 48 ч. В посмертных ранах указанные гистохимические сдвиги происходят как по краю раны, так и вдали от нее, что позволяет дифференцировать прижизненные изменения от посмертных. Характер посмертных изменений изученных дегидрогеназ в целом является однотипным.

Приведенные данные показывают, что при прижизненном повреждении кожи и мышечной ткани происходят выраженные гистохимические изменения дегидрогеназ и НАД-диафоразы. По сравнению с данными Lo Menzo и Castro (1965), Raekallio (1965, 1970) в наших опытах эти сдвиги происходили значительно раньше, особенно в поврежденных мышцах. Изменения в мышечной ткани в виде огрубения зерен диформазана можно обнаружить через 10 мин после механического повреждения, что, по-видимому, вызвано набуханием митохондрий клеток. Следовательно, усиление интенсивности окраски по краю повреждения в течение такого короткого времени является не результатом повышения активности ферментов, как указывают В.В. Смирнов и И.С. Круглова (1973), а следствием нарушения проницаемости оболочки митохондрий с отложением большого количества диформазана в единицу времени.

Рис. 1. Прижизненная резаная рана давностью 30 мин. По краю ее видно огрубение зерен диформазана. Реакция на МДГ Об. 20. Ок. 10.
Здесь и на рис. 2 и 4 стрелкой показан край раны.

Рис. 2. Прижизненная резаная рана давностью 2 ч. По краю ее наряду с крупными зернами диформазана видны «тающие» мышечные волокна с низкой ферментативной активностью. Реакция на ЛДГ Об. 20. Ок. 10.

Рис. 3. Прижизненная  резаная рана давностью 4 ч. По краю ее видна широкая зона некроза (а), которая переходит в зону повышенной активности фермента (б). Реакция на НАД-диафоразы. Об. 20. Ок. 10.

Рис. 4. Прижизненная резаная рана давностью 16 ч, проникающая до собственного слоя кожи. Видны центральная не- кротизированная зона (а) и зона повышенной активности фермента (б) Реакция на ЛДГ Об. 9. Ок. 10.