Исследование веществ кислого характера методом жидкостной хроматографии

С каждым годом в нашей стране и за рубежом  все шире распространяется злоупотребление наркотическими веществами, создающее угрозу здоровью и жизни людей. В нашей стране отмечается также распространение полинаркомании, связанной с употреблением «лекарственных коктейлей» для усиления наркотического действия.       Данные явления находят прямое отражение в результатах работы судебно-химического отделения Кемеровского областного бюро судебно-медицинской экспертизы. Ежегодно увеличивается процент положительных исследований, в которых  обнаружены наркотические вещества в сочетании с лекарственными веществами, как основного (димедрол, кофеин, производные фенотиазина, производные 1,4-бензодиазепина и др.) так и кислого характера (производные барбитуровой кислоты).

Для качественного доказательства наличия  вещества в соответствии с “Инструкцией   по  организации  и   производству   экспертных    исследований   в  бюро  судебно-медицинской   экспертизы”,   утвержденной   Приказом  МЗ  РФ   №161  от   24.04.2003 г. в нашем отделении используются: предварительный метод исследования –  хроматография в тонком слое сорбента, и такие подтверждающие методы, как спектрофотометрия в УФ-области спектра, газовая хроматография, жидкостная хроматография. С приобретением жидкостного хроматографа «Милихром А-02» (ЗАО «Эконова», г.Новосибирск), основным подтверждающим методом стала жидкостная хроматография. Исследование на вышеуказанном приборе позволяет одновременно получить два  доказательства – объем удерживания пика вещества и его спектральные характеристики, и провести количественное определение.  Пробоподготовка биоматериала проводится традиционными методами, такими как: изолирование подкисленной водой по Васильевой, прямой кислотный гидролиз и т.п. Извлечения, полученные этими методами, часто содержат  достаточно большое количество экстрактивных веществ, которые не только загрязняют колонку, но и могут накладываться на пики искомого вещества и искажать результат  исследования. Поэтому важной задачей стала подготовка проб для исследования на жидкостном хроматографе.

Мы поставили задачу сравнения трех способов подготовки проб для исследования «кислых» извлечений на хроматографе «Милихром А-02» в режиме скрининга. Нами были выбраны следующие способы: А) упаривание извлечения и настаивание сухого остатка  в растворе А ([4М перхлората лития+0,1М хлорной кислоты]:дистиллированная вода=1:19); Б) упаривание извлечения,  растворение сухого остатка в небольшом количестве хлороформа с последующей экстракцией полученного хлороформного раствора раствором А (данный метод предложен Барсегяном С.С. для исследования опиатов методом кислотного гидролиза и. на первый взгляд, неприменим для веществ кислого характера, но, как показало исследование, дает хорошие и стабильные результаты); С) упаривание  извлечения, растворение в горячей воде с дальнейшем подкислением водного раствора,  экстракцией его эфиром,  упаривание эфирного экстракта и  растворение сухого остатка в растворе А (метод предложен Карташовым В.А. для очистки «кислых» извлечений).  Для исследования брали «кислые» хлороформные  извлечения, полученные по методу Васильевой из разных объектов (желудок, печень, кровь, моча), не содержащие  вещество, используемое для затравки: добавляли в них точное количество фенобарбитала, растворенного в хлороформе и исследовали методом жидкостной хроматографии на хроматографе МИЛИХРОМ А-02. Условия хроматографирования:  колонка 75х2 мм,  заполнена обращенно-фазовым сорбентом ProntoSIL-120-5-C18,  детектирование при длинах волн 210 (опорная), 220, 230, 240, 250, 260,  280,  300 нм;  градиент: регенерация 5% раствором ацетонитрила в растворе А 800 мкл, от 5 до 100% ацетонитрила в растворе А до 4000 мкл, далее 100% ацетонитрил до 4300 мкл. Скорость   элюирования  100  мкл/мин;  частота  детектирования 0,18 сек. Определение и расчет концентрации фенобарбитала в пробе проводили с помощью компьютерного программного комплекса «Мультихром» (ЗАО «Амперсенд», г.Москва). Число исследований каждым методом подготовки проб – 8-10. Полученные результаты (средние из проведенных 8-10 определений) представлены в таблице.

Из таблицы следует, что наиболее подходящим является способ подготовки проб А. Однако, наряду с этим, следует отметить, что именно  при этом способе подготовки проб наблюдался наибольший разброс результатов определения (до 40%). Процент отклонения мало зависел от характера исследуемого органа. Основной причиной большого отклонения процента определения фенобарбитала от среднего является чистота полученного извлечения от экстрактивных веществ и жиров, что напрямую связано с состоянием органа, степенью выраженности его гнилостностных изменений. Так, при исследовании гнилостно-измененных органов, а также содержащих много жира, получали самые низкие результаты определения. Предугадать процент определения фенобарбитала при исследовании экспертного материала, как нам кажется, практически невозможно.

При использовании способов подготовки проб Б и С наблюдали небольшой разброс результатов определения (до 10%). Чистота извлечений, степень их жирности практически не влияли на процент определения фенобарбитала. Поэтому, несмотря на более низкий процент определения фенобарбитала при подготовке проб способами Б и С, их использование, на наш взгляд, дает наиболее предсказуемые результаты, которым можно дать судебно-медицинскую оценку.