Агглютинины анти-N растительного происхождения (Сообщение 2-е)

В 1948—1949 гг. Ренконен (Renkonen), Бойд и Регуера (Boyd и Reguera) установили, что экстракты из семян некоторых растений содержат агглютинины (лектины), специфичные к факторам изосерологической системы АВО (Н) крови человека. В 1953 г. Оттенсозер и Зильбершмидт (Ottensooser, Silberschmidt) в семенах Vicia graminea выявили агглютинин анти-N, тем самым положив начало исследованию агглютиногенов системы MNSs организма человека при помощи растительных «антител».

Изучение этого вопроса в дальнейшем привело к расширению знаний о видах растений, из семян которых можно извлечь лектин анти-N. В настоящее время известно 7 таких видов; Bauhinia purpurea, В. variegata, В. candicans, В. bonatiana, Vicia graminea, V. leganyana, Lens nigricans.

По литературным сведениям, агглютинин анти-N, выделенный из семян ряда растений, обладает титром до 1 :64 в солевой среде и до 1:128 в коллоидной. Некоторые агглютинины могут быть и неполными, проявляя свое специфическое действие в отношении эритроцитов человека групп N и MN только в коллоидной среде, оставаясь в то же время неактивными к эритроцитам группы М. Оттенсозер (1958) отметил хорошую сохраняемость экстракта из семян Vicia graminea в течение многих месяцев.

Большинство авторов применяло солевое экстрагирование лектина анти-N из семян. Бойд, Эверхарт и Мак Мастер (Everhart, McMaster, 1958) для повышения титра солевого экстракта осаждали спиртом его белки с последующим экстрагированием осадка физиологическим раствором.

Фитагглютинины анти-N абсорбируются эритроцитами группы N и в очень слабой степени группы М; обработка эритроцитов трипсином или папаином препятствует выявлению агглютиногена N экстрактами в такой же степени, как и сыворотками [Мякеля, Хаутала (Makela, Hautala, 1958)].

Заслуживает внимания возможность установления гетерогенетиче- ских антигенных связей между человеком и животными при помощи фитагглютинина анти-N. Штихнот, Хунгер и Фохт (Stichnot, Hunger и Vogt, 1959) этим методом установили наличие агглютиногена, подобного агглютиногену N человека, в эритроцитах лошади, а Левин, Оттенсозер, Селен и Поллицер (Levine, Celane, Pollitzer, 1955) —в эритроцитах шимпанзе. Первые из вышеназванных авторов отметили безрезультатность аналогичных опытов с использованием гетероиммунных кроличьих сывороток анти-N.

Фитагглютинины анти-N были высоко оценены рядом авторов как реагенты, не уступающие по своим свойствам сывороточным антителам (Бойд, Эверхардт, Мак Мастер, Левин, Оттенсозер, Селен, Поллицер). Интересен вь!вод Мякеля и Хаутала о том, что растительные агглютинины анти-N сходны с сывороточными или идентичны им. Выявление отмеченных свойств лектинов анти-N способствовало тому, что в некоторых местах начали выращивать нужные растения в оптимальных условиях (Оттенсозер).

Вследствие трудностей изготовления специфичной гетероиммунной сыворотки анти -N, обладающей достаточно высоким титром антител, возможность получения лектина анти-N вызывает определенный интерес, Перспективность изучения этого лектина определяется не только экономичностью и технической простотой извлечения его из семян, но и тем, что он может иметь некоторые положительные свойства, отличные от свойств сывороточного агглютинина анти-N. В дальнейшем, возможно, это могло бы быть использовано в различных областях биологии и медицины.

Мы подвергли исследованию семена растений Bauhinia purpurea, В. variegata, В. flava, Vicia graminea и V. leganyana, причем лектин анти-N был получен из первых 2 растений. Ни один из образцов семян не содержал гемолизинов.

Семена измельчали и одну весовую часть муки (1 г) экстрагировали 10 объемными частями (10 мл) стерильного физиологического раствора (первые 2 часа при 37°, а последующие 18—20 часов при 5°). Жидкость центрифугировали, фильтровали через обеззоленные бумажные фильтры и сохраняли при 5° без добавления антибактериальных веществ.

Гемагглютинационную способность экстрактов, как неразведенных, так и разведенных в разное количество раз, исследовали пробирочным способом при полуторачасовом контакте с 2% взвесью стандартных эритроцитов человека (3 капли жидкости + одна капля взвеси) и с последующим центрифугированием смеси в течение одной минуты при 1000—1500 оборотах. Учет результатов реакции производили невооруженным глазом и при помощи микроскопа.

Bauhinia purpurea была представлена 3 образцами семян: 1) Индия, фирма «G. Chose а. Со»; 2) Португалия, ботанический сад Лиссабонского университета; 3) Испания, ботанический сад университета в Валенсии. Семена из Индии не содержали каких-либо агглютининов к эритроцитам человека при проведении реакции агглютинации в солевой среде или сыворотке крови АВ. В семенах из Испании наряду с агглютинином анти-N (титр 1 : 128) имелся агглютинин анти-М (титр 1 : 32).

Экстракт из семян второго образца (жидкость бледно-зеленоватого цвета, опалесцирующая, с рН=6) в солевой воде избирательно агглютинировал эритроциты групп N и MN до разведения 1 : 16—1 : 64. Экстракт был специфичным, т. е. как в неразведенном, так и в разведенном виде не агглютинировал эритроциты с агглютиногенами Н, А, В, М, с, D, е, Р, S, s, Lea ‘ Leb и Lu. Температурный режим проведения реакции агглютинации при 37° по сравнению с 5 и 20° оказался наилучшим для действия лектина.

Титрование в сыворотке приводило к увеличению агглютинирующей способности экстракта до титра 1 : 128, причем М- или N-принад- лежность лиц, из крови которых была получена сыворотка, не оказывала шшяния на титр. Однако при титровании в сыворотке экстракт, оставаясь специфичным в разведении 1:1 , в последующих разведениях (в 4, 8 и 16 раз) слабо агглютинировал эритроциты групп М. Отмеченное явление усиливалось при реакции в забуференной желатиновой среде «биогель», приводившей к повышению титра до 1:256.

Весьма незначительное количество семян, которым мы располагали, не позволило продолжить дальнейшее изучение лектина. Повторное экстрагирование явилось безрезультатным.

Наличие лектина анти-N в семенах Bauhinia purpurea из Португалии и отсутствие его в семенах из Индии, возможно, связано с формой семян: первые были круглыми (1,4×1,5 см), вторые — овальными (1×1,4 см). На значение этого признака с определенностью указывает Бойд с соавторами. Семена из Испании были почти квадратными (от 0,7×0,7 до 0,9×1 см).

Семена Bauhinia variegata были собраны в 1961 г. в ботаническом саду Мельбурна (Австралия). Экстракт из этих семян имел светлый желтовато-зеленоватый цвет, опалесдировал, его pH = 6. Агглютинин анти-N в экстракте был хорошо выражен и при 20° имел титр по отношению к эритроцитам группы N 1 : 512—1 : 2048. Осуществление реакции агглютинации при 52 несколько увеличивало титр, а при 37° несколько уменьшало его. Наряду с этим отмечалась агглютинация и эритроцитов группы М (иногда отсутствующая или слабо выраженная в первых разведениях экстракта), интенсивность которой зависела от образцов крови и температурного режима реакции агглютинации: при 5° она усиливалась, при 37° ослабевала. Разведение экстракта физиологическим раствором не снимало этой побочной реакции — при разведе- нии в 50 раз (что вызывало снижение титра до 1 : 16) агглютинация эритроцитов группы М наблюдалась до 1:4. Групповая принадлежность эритроцитов по системе АВО (Н) не оказывала влияния на особенности реакции экстракта с эритроцитами групп М и N..

Титрование экстракта в человеческой сыворотке группы АВ и забуференной желатине приводило к повышению титра обоих лектинов, в первом случае (при 20°) весьма незначительному, во втором (при 37°) до титра 1 : 16 384. Заслуживает упоминания, что использование в качестве среды для агглютинации человеческих сывороток, консервированных борной кислотой до 2% ее содержания, вызывало полную потерю агглютинационной способности экстрактов, полученных из семян В. variegata и В. purpurea. Изотоничный 2% раствор борной кислоты оказывал аналогичное действие.

Для увеличения выхода получаемого экстракта оказался эффективным прием повторного экстрагирования семян В. variegata новой порцией физиологического раствора, добавляемого в прежнем объеме. Опыт по изучению скорости первичного извлечения агглютининов из семян путем забора проб экстрагирующей жидкости через разные промежутки времени показал, что экстрагирование при 37° длительностью в 10 минут является достаточным для выхода обоих лектинов. В течение дальнейших 20 минут достигалось наибольшее извлечение агглютининов; последующее экстрагирование не приводило к повышению их титра.

При осуществлении опытов, направленных на получение лектина, реагирующего с эритроцитами только групп N и MN, было принято во внимание указание Флетчер (Fletcher, 1959) о том, что агглютинацию эритроцитов группы1 М можно устранить прибавлением к экстракту из семян В. variegata глюкозы. В этом направлении нами было изучено 7 сахаров: d-глюкоза, сахароза, мальтоза, d-маннит, d-галактоза, лактоза и d-ксилоза. Различные разведения изотоничного раствора каждого сахара (10, 5, 1, 0,1, 0,01 и 0,001%) применялись вместо физиологического раствора при титровании экстракта по отношению к эритроцитам групп ОМ и 0N. Полное инактивирование агглютинина анти-М в

различных разведениях экстракта при сохранении агглютинина анти-N достигалось использованием 5% растворов d-глюкозы, сахарозы и d-ксилозы и 0,1% растворов d-галактозы и лактозы (реакция агглютинации осуществлялась при 20°). Растворы d-маннита и мальтозы действовали в равной степени угнетающе на оба агглютинина, поэтому они для указанной цели оказались непригодными. Устранение реакции экстракта с эритроцитами группы М сопровождалось некоторым снижением титра агглютинина анти-N.

В дальнейшем нами был установлен примечательный факт, что специфичного действия экстракта можно достигнуть и без использования раствора сахаров. Желательный эффект наступал, когда при титровании экстракта взамен физиологического раствора применялся экстракт из семян В. purpurea (Индия), не содержащий каких-либо агглютининов к эритроцитам человека. Этим приемом реакция с эритроцитами группы М полностью подавлялась при сохранении лектина анти-N с титром 1 : 32 (табл. 1).

Таблица 1

Влияние среды для реакции агглютинации на титр и специфичность экстракта при первичном и повторном экстрагировании семян Bauhinia variegata (реакция при 20°)

Примечание. Реакция с эритроцитами группы ОМ продемонстрирована на примере 2 образцов кровп, в которых агглютинация была обычной силы (1) и значительно выраженной (2).

Абсорбция экстракта равным объемом отмытых эритроцитов группы ОМ, осуществленная при 20° в течение 1х /г часов, привела к такому же ослаблению реакции с эритроцитами группы М, как и абсорбция кровью группы 0N (табл. 2). Титр агглютинина анти-N существенно снизился в обоих случаях, однако во втором случае истощение лектина анти-N было более выражено. Тем самым мы не смогли подтвердить мнение Мякеля и Хаутала, что лектин анти-N абсорбируется только эритроцитами группы N.

Таблица 2

Влияние абсорбции на реакцию экстракта из семян Bauhinia variegata с эритроцитами групп ОМ и 0N (экстракт предварительно разведен, реакция при 20°)

Результаты вышеизложенных опытов не позволяют разрешить вопрос, вызывается ли реакция экстракта из семян В. variegata с

эритроцитами группы М существованием изолированного лектина анти-М или же она обусловлена другим веществом с панагглютинабильными свойствами, неспецифически действующим на эритроциты разных трупп изосерологической системы MNSs.

При параллельном исследовании эритроцитов крови 55 лиц при помощи экстракта анти-N, разведенного в 2 раза 5% раствором глюкозы, и кроличьей гетероиммунной сыворотки анти-N было отмечено совпадение результатов в 54 случаях. Составивший исключение образец крови, по-видимому, содержавший слабо выраженный агглютиноген N, дал слабо положительную реакцию с экстрактом и с одной из сывороток; с другими 2 сыворотками анти-N агглютинации не отмечалось.

Экстракт анти-N, разведенный 5% раствором глюкозы, в сильной степени агглютинировал эритроциты кролика (6 особей), кошки (2) и свиньи (2) и не агглютинировал эритроциты белой крысы (2), морской свинки (2), курицы (2), гуся (2), индейки (2), козы (2), барана (2). теленка (2), собаки (2), лошади (2). Эти результаты, с нашей точки зрения, можно расценивать не только как доказательство наличия в хрови кролика, кошки и свиньи антигена, сходного с агглютиногеном N организма человека. Учитывая свойства фитагглютининов избирательно агглютинировать эритроциты некоторых видов животных, есть основание предполагать, что экстракт из семян Bauhinia variegata выявляет какую-то общность гетероантигенных свойств эритроцитов человека (групп N и MN), кролика, кошки и свиньи.

В семенах Bauhinia variegata, присланных из ботанического сада Аделаиды (Австралия), был выявлен строго специфичный агглютинин анти-N с титром 1:32.

Солевой и хлороформный экстракты из семян Vicia graminea (Аргентина) не содержала лектинов. Экстракты из семян Vicia leganyana (Полтавская область и Чехословакия) и Bauhinia flava (Нигерия) до разведений 1:256—1:1024 и 1:32 000—1:128 000 соответственно агглютинировали эритроциты человека вне зависимости от их групповой характеристики.