Определение пропанорма в трупном материале (случай из практики)

В декабре 2009 года в отделение были присланы для проведения исследования на наличие лекарственных препаратов и этанола биологические объекты: внутренние органы (печень, желудок), кровь и моча от трупа гр-ки Г. 1986 года рождения. В обстоятельствах дела было указано – отравление лекарственными препаратами (предположительно пропанормом).

Препарат ПРОПАНОРМ (международное непатентованное название пропафенона гидрохлорид) относится по своим фармакологическим свойствам к антиаритмическим препаратам.

Рис. 1. 1-[2-[2-Гидрокси-3-(пропиламино)пропокси]фенил] -3-фенил-1-пропанон

Соответствующей литературы по химико-токсикологическому исследованию данного препарата нами найдено не было. Был сделан запрос фармакопейной статьи на данный препарат, в контрольно-аналитическую лабораторию по Контролю и оценке качества медпрепаратов. Исходя из полученных данных в фармакопейной статье, а также из химической структуры препарата была предложена схема проведения исследования. В качестве «свидетеля» использовался метанольный раствор таблеток пропафенона гидрохлорида, приобретенных в аптеке.

Изолирование из внутренних органов проводили водой, подкисленной щавелевой кислотой по методу Васильевой, изолирование из мочи – подкисленной 2н раствором соляной кислоты по методу Изотова.

Исследование извлечений из кислой и щелочной среды проводили методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) с использованием в качестве «свидетелей» метанольного раствора пропафенона гидрохлорида (пропанорма), хлороформных растворов других фармакологических групп.

Условия ТСХ исследования:

• – 2 высокоэффективные пластинки «Сорбфил-254» размером 10×10 см на целлулоидной подложке;
• – 2 пластинки «Силуфол» размером 10×14 см на алюминиевой подложке.

Системы растворителей, используемые для насыщения хроматографических камер:

• – для исследования извлечения из кислой среды – СР № 1 хлороформ:ацетон (9:1);
• – для исследования извлечения из щелочной среды – СР № 2 этилацетат:метанол:25% раствор аммиака (85:10:5).

Пластинки выдерживали в камерах до поднятия слоя растворителей до линии фронта. Пробег фронта растворителей для пластинок «Сорбфил 254» – 9 см, для пластинок «Силуфол» – 8×14 см.

Метчик пропафенона гидрохлорида, исходя из химической структуры, обладает выраженными основными свойствами, поэтому при исследовании извлечений из кислой среды методом тонкослойной хроматографии препарат выявлен не был.

При проведении ТСХ-исследования извлечений из щелочной среды по 2,0 мл извлечений из внутренних органов и мочи с помощью капилляра переносили в точки на стартовые линии: 2-х пластинок «Сорбфил 254» (П № 1 и П № 2) и на стартовую линию пластинки «Силуфол» 8×14 (П № 3). После последовательного выдерживания пластинок в хроматографической камере с СР № 2 и высушивания их при комнатной температуре для обработки хроматографической пластинки П № 1 использовали следующие реактивы: 10 % раствор хлорида окисного железа, 0,1 % раствор нитрита натрия в хлорной кислоте, реактив Драгендорфа в модификации Мунье. В зонах хроматографирования исследуемых извлечений из внутренних органов и мочи наблюдали проявление пятен на одном уровне и одного цвета с проявленным пятном «свидетеля» пропафенона, после обработки реактивом Драгендорфа в модификации Мунье, с Rf = 0,73 желтого цвета с темно-оранжевой каймой по краям пятна.

Для обработки П № 2 применялась концентрированная серная кислота; после обработки пластинки парами формальдегида (реакция на фенольную группу) наблюдали проявление пятна ярко-желтого цвета с Rf = 0,73. После обработки пластинки водой окрашивание пятен исчезло. Затем пластинку обрабатывали раствором йодплатината, подкисленного концентрированной соляной кислотой. В зоне хроматографирования исследуемых извлечений – проявление пятна ярко-брусничного цвета на одном уровне и одного цвета с проявленным пятном метчика. «Свидетель» проявлен с Rf = 0,73.

Для обработки П № 3 использовали раствор нингидрина в ацетоне (реакция на первичную аминогруппу). После выдерживания пластинки в токе теплого воздуха в зонах хроматографирования исследуемых извлечений и «свидетеля» пропафенона наблюдали проявления пятен ярко-розового цвета с Rf = 0,43.

Далее проводили исследование методом газожидкостной хроматографии метанольного раствора препарата и извлечений из внутренних органов и мочи. Условия хроматографического разделения: детектор – ионизационноплазменный, колонка НР – 5 25×0,32, скорость газа – носителя азота – 70 мл/мин, водорода – 30 мл/мин, воздуха – 300 мл/мин температура детектора 260 °С, температура испарителя 240 °С, температура колонки 180 °С с программированием температурного режима до 260 °С и выдерживанием общего времени анализа 25 минут.

Объемы исследуемых растворов: метанольного раствора пропафенона 1 мкл, извлечений из печени, желудка и мочи – по 5мл. Растворы переносили в выпарительные чашки, испаряли до сухого остатка. Полученные остатки растворяли каждый в 50 мкл 95% этанола. Объем растворов, вводимых в инжектор хроматографа «Кристалл 2000М»в, – 2 мкл. На хроматограмме исследуемого метанольного раствора пропафенона отмечен пик со временем удерживания 8,990 мин (рис. 2).

Рис. 2. Хроматограмма «свидетеля» – метанольного раствора таблеток пропафенона

После проверки микрошприца на чистоту по 2 мкл спиртовых растворов последовательно вводили в инжектор газового хроматографа. На хроматограммах в анализируемых извлечениях отмечен пик со временем удерживания 8,990, соответствующий времени удерживания пропафенона (пропанорма).

Далее проводили исследование методом спектрофотометрии метанольного раствора препарата и извлечений из внутренних органов и мочи.

Рис. 3. Спектрофотограмма метанольного раствора пропафенона гидрохлорида (пропанорм в метаноле)

Сухие остатки после газовой хроматографии растворяли каждый в 5 мл метанола. Полученные растворы помещала в кюветы с толщиной пропускающего слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения использовали метанол. Снимали спектры поглощения в диапазоне волн от 220–350 нм на спектрофотометре СФ-56. Наблюдали максимумы поглощения раствора пропафенона (пропанорма) при длинах волн 250 и 305 нм (рис. 3).

Аналогичные максимумы поглощения при тех же длинах волн наблюдали в исследуемых метанольных растворах извлечений из печени, желудка и мочи.

Выводы:

1. Предложена схема анализа пропафенона гидрохлорида:

• – изолирование из трупного материала: из внутренних органов – методом Васильевой; из мочи – методом Изотова;
• – хроматография в тонком слое сорбента извлечений из щелочной среды и последующим проявлением реактивами:
• – Драгендорф по Мунье, Марки, нинигидрин в ацетоне, подкисленный йодплатинат.
• – исследование извлечений из трупного материала из щелочной среды методом газожидкостной хроматографии на аппаратно-програмном комплексе «Хроматек-Кристалл 2000М».
• – исследование извлечений из трупного материала из щелочной среды методом спектрофотометрии на спектрофотометре СФ-56.