Методика выявления нейросекреторных включении в нервных клетках гипоталамуса
/ Подымов В.К. // Судебно-медицинская экспертиза. — М., 1964 — №1. — С. 12-15.
Научно-исследовательский институт судебной медицины (дир. — проф. В.И. Прозоровский) Министерства здравоохранения СССР, Москва
Поступила в редакцию 19/XI 1963 г.
В настоящее время в научных судебномедицинских исследованиях наряду с гистологическими методами успешно используется ряд гистохимических методик (В. И. Алисиевич, 1962, 1963; Н. А. Митяева; В. Г. Науменко и Е. А. Савина; Г. Я. Пеккер; Е. А. Савина; В. И. Яковлева и др.).
Одним из моментов, затрудняющих применение гистохимических методик, является их сложность. Предлагаемый нами метод выявления нейросекреторных гранул в гипоталамо-гипофизарной системе отличается простотой и доступностью применяемых реактивов.
Для выявления нейросекреторного вещества в ядрах гипоталамуса имеются две общепринятые окраски, созданные Гомори (Gomori).
Первая — хромгематоксилин-флоксином — наиболее распространена, она разработана в 1939 г. для выявления а- и (5-клеток островков Лангерганса поджелудочной железы. В 1949 г. ее впервые использовали Баргманн и Хильд (Bargmann и Hild) для изучения нейросекреторных процессов в гипоталамо-гипофизарном тракте.
Заключается эта методика в окислении срезов раствором, содержащим равные части 0,3% растворов перманганата калия и серной кислоты, окраске срезов в хромгематоксилине с докраской флоксином. А.Л. Поленов вместо флоксина применяет кислый фуксин.
Данная окраска выявляет секреторные гранулы в телах нейронов и в их отростках, а также межклеточный нейросекрет. Нейросекреторное вещество окрашивается либо хромгематоксилином в темно-синий цвет (гомориположительный нейросекрет), либо фуксином в малиновый или розовый цвет (гомориотрицательный нейросекрет). Некоторые гранулы окрашиваются в промежуточные цвета. Хромгематоксилин также хорошо выявляет эластические волокна в стенках кровеносных сосудов.
Преимущества окраски: выявление не только гомориположительного, но и гомориотрицательного нейросекрета; хорошее выявление эластики сосудов; довольно четкая видимость нейросекрета в хорошо выкрашивающихся отростках нейронов; четкое окрашивание ядрышка. Недостаток окраски: неизвестность ее теоретических основ, а следовательно и границ ее специфичности; нечеткое выявление нейросекреторных гранул в телах клеток — хромгематокеилин красит секрет, клеточные ядра, глыбки Ниссля (Пирс); длительность приготовления красящей смеси (хромгематоксилина)—48 часов, первая промывка в воде занимает 6—12 часов, вторая — Н/ 2—3 часа.
Вторая методика — окраска альдегид-фуксином — предложена Гомори в 1950 г. для выявления эластичной ткани. Срезы фиксируют в смеси сулема/формалин = 9/1 помещают в раствор Люголя, где удаляются остатки ртути и происходит их окисление, и докрашивают по Массону, гематоксилин-оранжем или азаном по Маллори—Гейденгайну. Недостаток данной методики — слабое окисление в растворе Люголя — устранен Габом и Скоттом (Gabe, Scott), которые окисляли срезы кислым раствором перманганата калия. Такая обработка резко усиливала восприятие гистологическими структурами альдегид-фуксина. Эту же модификацию применил А. П. Дыбан для выявления в передней доле гипофиза а- и 6-базофильных клеток.
Модификация В. Ф. Майоровой заключается в предварительном окислении срезов кислым раствором перманганата калия и докраске 0,1% раствором метиленовой синьки. В препаратах гипоталамуса нейросекреторная субстанция выявляется в виде гранул пурпурно-фиолетового цвета в телах и отростках нервных клеток. В нейронах, докрашенных метиленовой синькой, видно также ядро с ядрышком и тигроидная субстанция. В межклеточных пространствах паравентрикулярных ядер гипоталамуса интерцеллюлярный нейросекрет окрашивается в виде более грубых пурпурно-фиолетовых глыбок. В. Ф. Майорова пишет: «...наиболее специфичным для выявления нейросекреторной субстанции является метод Гомори с альдегид-фуксином...».
Преимущества методики: одновременное выявление нейросекреторного вещества и тигроидной субстанции (некоторые авторы находят обратную зависимость между нейросекреторным веществом и РНК, связанной с тигроидом); экономия времени. Недостатки окраски: неясность механизма этой реакции (Пирс); высокая чувствительность, но низкая специфичность раствора альдегид-фуксина, который при вступлении в реакцию с альдегидами образует неполярные связи [Бангл (Bangle) и Браун-Фалько (Braun-Falco)]; необходимость химически чистого паральдегида и чистого фуксина. Механизм окрашивания нейросекреторного вещества при помощи описанных методов остается неясным, и методы никоим образом нельзя считать специфическими (Пирс).
Точная природа и состав нейросекреторных гранул, красящихся хромгематоксилином и альдегид-фуксином, не выяснены, однако известно, что гормоны задней доли гипофиза — вазопрессин и оксито- цин — содержат до 19% цистина [Дю Виньо (Du Vigneaud); Адамс и Слопер (Adams, Sloper), 1955, 1956]. Впервые окрасить вещества, содержащие цистин, в задней доле гипофиза попытались Барнетт и Зелиг- ман (Barnett, Seligman, 1952, 1954) с помощью диоксидинафтилдисуль- фита, причем протоплазма некоторых нейронов супраоптического ядра собак и крыс дала более интенсивную реакцию на сульфгидрильные группы, чем другие гипоталамические нейроны.
Слопер (1954, 1955) независимо от Барнетта модифицировал метод Адамса (тиогликолат-ферри-феррицианид) окраски на цистин, получив интенсивную реакцию в клетках супраоптического и паравентрикулярного ядер у собак. Это свойство резко отличало указанные ядра от других образований гипоталамуса. Окрашенное вещество распространялось вниз по аксонам в виде нитей с утолщениями (как нанизанный бисер) вдоль супраоптико-гипофизарного тракта. Это было морфологическое выражение того, что Баргманн (1949, 1950) оценивал как проявление нейросекреции.
Дальнейшее выявление дистина пошло не по линии его восстановления до сульфгидрильных групп, а по пути его окисления с помощью надмуравьиной кислоты в цистеиновую кислоту (синонимы: цистинсуль- фониловая, аланин-(3-сульфокислота). В состав последней входит суль- фогруппа SO 2 • ОН, обладающая резко выраженными кислотными свойствами, т. е. сильным отрицательным зарядом. Этот радикал (SO2 • ОН) хорошо выявляется с помощью основной окраски — алцианового синего. Метод надмуравьиная кислота — алциановый синий выявляет нейросекреторный материал с большой специфичностью, и эту реакцию нужно считать наилучшей (Пирс).
Преимущества: известна теоретическая основа; реакция высоко- специфична. Говорить о качестве препаратов мы не можем, так как эту методику мы не применяли. Недостатки окраски: дефицитность 98% муравьиной кислоты служащей для приготовления надмуравьи- иой кислоты; сложность приготовления красящего раствора алцианового синего (нагревание).
Методика М. Г. Шубича для гистохимического обнаружения кератина с помощью кислого раствора основного коричневого базируется на этих же принципах. Однако он считает, что совершенно достаточно для окисления цистина применение перманганата калия вместо надмуравьиной кислоты. Для цветного обнаружения отрицательно заряженных сульфогрупп, образующихся в цистине кератина, автор избрал кислый раствор основного коричневого. Он показал, что основной коричневый при этом pH избирательно связывается с сульфатной группировкой, входящей в состав кислых мукополисахаридов и обладающей сильным отрицательным зарядом. Другие отрицательно заряженные группы, входящие в состав микроструктур, основным коричневым при низком pH не окрашиваются.
Как уже указывалось, в молекулах кератина после окисления перманганатом калия появляются многочисленные сульфогруппы, по своим свойствам аналогичные сульфатным группировкам кислых мукополисахаридов. Поэтому для выявления окисленного кератина М. Г. Шубич считает теоретически оправданным применение кислого раствора основного коричневого (бисмарк-браун, везувин). Его опыты подтвердили эти теоретические предположения; они привели к интенсивной окраске в окисленных препаратах.
Предлагаемая нами методика обнаружения нейросекреторной субстанции в гипоталамо-гипофизарной нейросекреторной системе имеет то же теоретическое обоснование, что и методы Адамса—Слопера и М. Г. Щубича, т. е. основана на выявлении сульфогрупп окисленного цистина, входящего в состав нейросекреторных гранул. Окраска производится в следующем порядке. Материал фиксируют в смеси 9 частей сулемы и 1 части формалина или в жидкости Буэна и заливают в парафин. Затем срезы отмывают в ксилоле, помещают последовательно в спирты нисходящей концентрации и отмывают водой. В случае сулемовой фиксации осадок ртути удаляют раствором Люголя, обесцвечивают срезы 5% раствором гипосульфита и ополаскивают дистиллированной водой. Потом их окисляют смесью равных частей 0,3% растворов перманганата калия и серной кислоты, обесцвечивают 2% раствором метабисульфита натрия, промывают дистиллированной водой и в течение 2—3 часов окрашивают кислым раствором основного коричневого (бисмарк-браун, везувин) (прим. — 0,5 г основного коричневого растворяют в смеси 80 мл спирта и 20 мл 1 н. раствора соляной кислоты. Перед первым употреблением смесь фильтруют.) под контролем микроскопа. После этого срезы трижды отмывают 70° спиртом. С целью выявления точной локализации нейросекреторных включений в нейронах срезы докрашивают метиленовым синим, кислым фуксином, светлым зеленым. Наиболее четкую контрастную картину дает докраска светлым зеленым. Докраску производят в течение 1—2 мин. в 0,1% растворе светлого зеленого в слегка подкисленном 700 спирте. Затем срезы ополаскивают дистиллированной водой, осушивают фильтровальной бумагой и переносят в 96 и 100° спирты, карбол-ксилол, ксилол, бальзам.
Рис. 1. Нейросекреторное вещество
в клетках паравентрикулярного ядра
гипоталамуса человека. Окраска
бисмарк-браун-светлый зеленый. Х200.
В результате нейросекреторные гранулы в нейронах гипоталамуса человека красятся в интенсивный коричневый цвет, ядрышко — в зеленый с буроватым оттенком, а цитоплазма — в светло-зеленый. Четко красятся и межклеточный нейросекрет и скопления нейросекрета в нейрогипофизе (рис. 1—3).
Недостатки методики: красится, видимо, только гомориположительный нейросекрет; не красится субстанция Ниссля; окраска требует около 3 часов. Преимущества: четкое теоретическое обоснование реакций, лежащих в основе окраски; высокая специфичность; сравнительная простота приготовления и доступность реактивов; очень четкое выявление нейросекреторной зернистости — темно-коричневая на светло-зеленом фоне.
Рис. 2. Нейросекреторная субстанция в клетках паравентрикулярного ядра гипоталамуса человека. Окраска бисмарк-браун-светлый зеленый. Х400 | Рис. 3. Нейросекреторные гранулы в клетке паравентрикулярного ядра гипоталамуса человека. Окраска бисмарк-браун-светлый зеленый. Х1500 |
Предлагаемая методика является наиболее простым из существующих способов выявления нейросекреторного вещества и характеризуется высокой специфичностью.
похожие статьи
Актуальные вопросы гистологического исследования при экспертизе живых лиц / Кулеша Н.В. // Избранные вопросы судебно-медицинской экспертизы. — Хабаровск, 2018. — №17. — С. 125-128.