Определение алкоголя в крови ферментативным методом

/ Лобанов В.И. // Судебно-медицинская экспертиза. — М., 1964 — №4. — С. 32-34.

Лобанов В.И. Определение алкоголя в крови ферментативным методом

Поступила в редакцию 9/Х 1963 г.

ссылка на эту страницу

В последнее время за границей широко применяют ферментативный (энзимный) способ определения этилового алкоголя в крови живых лиц и трупов, так называемый метод АДГ.

Сущность его состоит в том, что алкогольдегидрогеназа (АДГ) катализирует окисление этилового спирта в уксусный альдегид.

Акцептором водорода в данной реакции является дифосфопиридиннуклеотид (DPN), который в виде восстановленной формы адсорбирует ультрафиолетовые лучи в области 366 ммк.

С помощью стандартного раствора строят калибровочный график, а затем по измеренной на фотометре экстинкции исследуемого раствора производят расчет концентрации алкоголя.

Комплект ферментов для определения алкоголя в крови
Рис. 1. Комплект ферментов для определения
алкоголя в крови.

Калибровочный график
Рис. 2. Калибровочный график.

Мы определяли алкоголь в искусственных смесях с кровью и в экспертном материале одновременно 3 методами: высаливанием по А.И. Гринбергу, нитритным методом по Е.С. Ковалевой, энзимным методом по Bucher и Theorell с некоторыми изменениями, принятыми в Берлинском институте судебной медицины.

Применяли комплекты ферментов Blutalkohol-Test (Fermognost) производства ГДР (Дрезден), содержащие 2 флакона DPN и 1 флакон АДГ (рис. 1). Один комплект дает возможность проводить до 50 исследований. Хранят ферменты в холодильнике при температуре от 0 до 5°.

Построение калибровочной кривой и методика определения алкоголя. Для приготовления стандартного раствора с точным содержанием этилового алкоголя можно применять солянокислый гликокол-этиловый эфир (по Серенсену), который в процессе щелочного гидролиза образует этиловый алкоголь. Для этой цели также рекомендуется абсолютно свободный от воды этиловый алкоголь фирмы «Меrск-972». Мы готовили стандартный раствор на абсолютном этиловом алкоголе.

По ОД, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5 и 0,6 мл точно приготовленного 1% этилового алкоголя вносили в пробирки, после чего в каждую пробирку добавляли по 1,4 мл крови, не содержащей алкоголя1 . Содержимое пробирок доводили до 2 мл дважды дистиллированной водой и тщательно перемешивали.

В центрифужную пробирку вносили по 4 мл хлорной кислоты (2,9 мл 70% хлорной кислоты с удельным весом 1,67 помещают в мерную колбу емкостью 100 мл и доводят до метки дважды дистиллированной водой) и 0,5 мл стандартного раствора этилового спирта с сывороткой или 0,5 мл исследуемой крови, тщательно перемешивали стеклянной палочкой, закрывали резиновой пробкой и центрифугировали в течение 5 мин. при 3000 об/мин. При этом выпадает осадок белков.

В градуированную пробирку пипеткой последовательно вносили 4,8 мл буферного раствора2 , 0,1 мл разведенного DPN3, осторожно перемешивали содержимое вращением пробирки и постукиванием по стенкам. Затем к жидкости добавляли 0,1 мл центрифугата, полученного ранее из крови или сыворотки. В эту же пробирку вносили 0,02 мл суспензии АДГ, еще раз хорошо перемешивали, тщательно закрывали пробкой и помещали на 70 мин. в термостат или на водяную баню при 21—26а (оптимальная температура 25°), после чего измеряли экстинкцию раствора при длине волны 366 ммк.

Одновременно ставили слепой опыт с кровью или сывороткой ее, не содержащей алкоголя.

Экстинкцию измеряли на фотометре «Хавеман» в кювете с толщиной слоя 1 см.

Полученная калибровочная кривая (рис. 2) пригодна для определения содержания этилового алкоголя в крови. При определении алкоголя в сыворотке крови необходим другой график. Для концентраций спирта выше 2,5% берут двойную дозу DPN и строят специальный калибровочный график.

По такой методике определяли алкоголь в искусственных смесях с кровью. Одновременно его определяли высаливанием, по А.И. Гринбергу и нитритным методом Е.С. Ковалевой. Результаты приведены в табл. 1.

Таблица 1

Содержание алкоголя (в ‰) в искусственных смесях с кровью при различных методах определения

Сдержание
алкоголя
смеси
Найдено алкоголя
высаливаниемнитритным
методом
нитритным
методом
1,60

0,70

0,90

2,30

1,20

1,5

0,50

1,40

2,10

2,80

3,20

3,80

1,80

1,30

0,50 

 0,60

 2,00

0,90

1,30

0,15

1,00

1,90

2,50

3,00

3,65

1,50

1,40

0,60

0,60

2,10

0,80

0,55

0,70

2,20

1,00

2,50

2,10

3,70

1,60

1,40

0,55

0,70

2,20

1,00

1,40

0,40

1,25

2,10

2,65

2,10

3,75

1,60

 

Полученные данные показывают, что ферментативный метод определения этилового спирта достаточно точен и не уступает нитритному методу и высаливанию, а в ряде случаев дает лучшие результаты.

Всего мы провели 76 определений спирта ферментативным методом, в том числе и в экспертном материале. При исследовании экспертного материала методами высаливания, нитритным и ферментативным для исследования брали кровь.

Результат определения этилового алкоголя в экспертном материале приведен в табл. 2, из которой видно, что расхождения при применении указанных методов не превышают 0,3°/оо. При этом ферментативный метод имеет ряд существенных преимуществ. Он является микрометодом и требует в 400—600 раз меньше материала, чем высаливание. Его можно применить для определения этилового алкоголя в крови живых лиц и трупов. Он

Таблица 2

Результат определения этилового алкоголя в крови

 

Метод определения
высаливаниянитритныйферментативный
вес
крови
(в г)
найдено
этилового
спирта
(в ‰)
вес
крови
(в г)
найдено
этилового
спирта
(в ‰)
объем
крови
(в мл)
найдено
этилового
спирта
(в ‰)
300

250

300

300

286

300

220

 

 

0,70

1,50

2,00

1,30

1,90

1,40

1,20

 

 

300

250

300

300

286

300

220

 

 

0,90

1,60

2,20

1,45

1,95

1,40

1,40

 

 

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,75

1,50

2,10

1,40

2,00

1,50

1,35

0,50

0,95

 

Метод определения достаточно прост и особенно удобен для серийных определений. При этом 0, 5 мл крови после осаждения белков дают возможность провести ряд повторных определений.

Выводы

  1. Построен калибровочный график и определено содержание этилового алкоголя в одной и той же крови одновременно энзимным, нитритным методами и высаливанием.
  2. На экспертном материале показано, что расхождение в результатах, полученных при определении указанными 3 методами, не превышает 0,3%о. Ферментативный метод имеет ряд преимуществ: является микрометодом, может быть применен для определения этилового алкоголя в крови живых лиц и трупов, его можно применять при серийных определениях.

 

1 Если для приготовления стандартных растворов используют сыворотку (1,4 мл), то для определения алкоголя необходима также сыворотка крови.

2 8,34 г пирофосфата натрия, 2,08 г солянокислого семикарбазида и 0,416 г гликокола растворяют в 200 мл дважды дистиллированной воды, добавляют 8,34 мл 2 н. раствора едкого натра и доводят дважды дистиллированной водой до 250 мл. Полученный буферный раствор имеет pH около 8,7.

3 К содержимому склянки с DPN добавляют 2,85 мл дважды дистиллированной воды, закрывают пробкой и осторожно встряхивают в течение 5 мин. Разведенный DPN можно хранить в холодильнике при температуре от 0 до +5° в течение 2 недель.

 

похожие статьи

Алкоголь-ассоциированные причины смерти и посмертная этанолемия / Чижикова И.О., Шигеев С.В. // Избранные вопросы судебно-медицинской экспертизы. — Хабаровск, 2021. — №20. — С. 144-147.

Динамика морфометрических изменений нейронов III и V слоя коры головного мозга при острых отравлениях азалептином в сочетании с этиловым спиртом / Баширова А.Р. // Избранные вопросы судебно-медицинской экспертизы. — Хабаровск, 2021. — №20. — С. 22-23.

Клетки Пуркинье мозжечка при отравлении клозапином в сочетании с алкоголем (экспериментальное исследование) / Голубев А.М., Сундуков Д.В., Чурилов А.А., Ершов А.В., Романова О.Л., Телипов И.Н. // Судебная медицина. — 2019. — №4. — С. 9-14.

Перспективы использования параметров окислительной модификафии белков сыворотки крови для установления длительности агонального периода / Эделев И.С., Обухова Л.М., Андриянова Н.А., Эделев Н.С. // Судебная медицина. — 2019. — №3. — С. 28-32.

Обнаружение рокурония в биологических объектах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии / Матвеева А.А., Федорова К.В., Лопушанская Е.М., Киреева А.В. // Судебная медицина. — 2019. — №2. — С. 49-51.

Изучение распределения неостигмина метилсульфата в организме теплокровных животных после внутрижелудочного введения / Алехина М.И., Шорманов В.К., Никитина Т.Н., Маркелова А.М. // Судебно-медицинская экспертиза. — М., 2019. — №2. — С. 40-47.

больше материалов в каталогах

Острое отравление алкоголем

Судебно-химические исследования