Определение морфина в крови и моче

/ Рубцов А.Ф. Саломатин Е.М.  // Судебно-медицинская экспертиза. — М., 1974 — №2. — С. 45-48.

Рубцов А.Ф., Саломатин Е.М. Определение морфина в крови и моче

УДК 340.67:[615.212.7:547.943

Научно-исследовательский институт судебной медицины (дир. — проф. В.И. Прозоровский) Министерства здравоохранения СССР, Москва

ссылка на эту страницу

Большинство методик доказательства морфина в крови и моче базируется на использовании неспецифичных реакций его обнаружения и определения.

Разработка чувствительных, специфичных химико-токсикологических методов определения морфина в биологических жидкостях связана с большими затруднениями, обусловленными химическими свойствами морфина, физиологическими и метаболическими процессами, протекающими в организме человека, а также значительным сходством в химическом строении, фармакологическом действии и метаболизме отдельных алкалоидов опия (Redmond и Parker, 1963; Woods, 1956; Tetsuo Oka, 1954, и др.).

Трудности доказательства морфина в крови и моче химическими методами обусловлены также необходимостью разработки не только специфичной, но и высокочувствительной методики определения.

Экспериментальная часть

Для качественного обнаружения морфина, извлеченного из крови и мочи, использовали хроматографию в тонком слое силикагеля КСК (120 меш).

Для обнаружения морфина использовали платинохлористоводородный реагент1.

Спустя 30—60 мин на хроматограммах наблюдали окрашенные пятна на уровне метчика (морфина) при исследовании мочи, не содержащей морфина. Таким образом, платинохлористоводородный реагент неспецифичен и не может быть использован для качественного доказательства морфина в моче без тщательной очистки от экстрактивных веществ.

Специфичными реагентами для обнаружения морфина и его аналогов на хроматограммах являются реактивы Марки и Фреде. Чувствительность реакции по Clarke составляет 0,05 мкг морфина, а по исследованиям Л.М. Власенко (1962) реакцией Марки обнаруживается 0,3 мкг и реакцией Фреде 0,1 мкг морфина. Но реактивы Марки и Фреде не позволяют отдифференцировать морфин от некоторых его аналогов. В этой связи необходимо производить не только очистку, но и отделять морфин от других веществ.

Xроматографическое разделение морфина и его аналогов в тонком слое сорбента.

Приготовление пластинок: 6,1 г силикагеля КСК (120 меш), 0,36 г гипса, 19—20 мл дистиллированной воды смешивали в фарфоровой ступке до получения однородной суспензии, которую равномерно наносили методом «поливки» на стеклянные пластинки размером 13×18 см. После подсушивания при комнатной температуре пластинки активировали в течение 2 ч при 110°. На расстоянии 15 мм от нижнего края пластинки с помощью микрошприца емкостью 10 мкл наносили по 10—20 мкг метанольных растворов морфина, его аналогов и других соединений, вступающих во взаимодействие с реактивами Марки и Фреде. Хроматографирование производили в двух системах растворителей: этанол—диоксан—бензол—аммиак 1:8:10:1 (С-1) и этилацетат —метанол — аммиак 17:2:1 (С-2). Фронт растворителей 13—14 см.

Результаты опытов представлены в табл. 1.

При проведении экспериментов с кровью и мочой человека, к которым были добавлены различные количества морфина, установили, что лучшей является система растворителей, содержащая этилацетат—метанол—аммиак 17:2:1, так как позволяет отделить морфин от балластных и экстрактивных веществ, которые извлекаются из крови и мочи вместе с морфином. Они увлекаются фронтом растворителя и не мешают идентификации морфина.

Таблица 1

Хроматографическое разделение морфина в тонком слое силикагеля КСК

Соединение

Величина Rf

Окрашивание

С-1

с-2

с реактивом Марки

с реактивом Фреде

Морфин

0,10—0,22

0,32—0,39

Красно-фиолетовое

Фиолетовое

Героин

0,44—0,61

0,52—0,66

»

»

Кодеин

0,27—0,36

0,39—0,54

Фиолетовое

Фиолетово-зеленое

Дионин

0,28—0,43

0,41—0,46

Сине-фиолетовое

Зелено-синее

Омнопон

0,16—0,23 и 0,86—0,94

0,33—0,39

Красно-фиолетовое

Фиолетовое

Наркотин

0,92—0,93

0,00

Фиолетовое

Сине-зеленое

Нарцеин

0,00

0,00

Красно-фиолетово-бурое

Сине-зелено-бурое

Папаверин

0,76—0,85

0,79—0,83

Фиолетовое

Зеленое

Аминазин

0,68—0,90

0,82

Розовое

Красно-фиолетовое

Дипразин

0,65—0,85

0,77

»

Розовое

Динезин

0,84—0,96

0,96

»

»

Тизерцин

0,94—0,96

0,94

Фиолетовое

Фиолетовое

Терален

0,92—0,97

0,92

Розовое

Розовое

Мепазин

0,65—0,90

0,80

Пурпурное

Пурпурно-фиолетовое

Фенотиазин

0,94

0,93

Розовое

Розово-фиолетовое

Имизин

0,62—0,90

0,73

Синее (при нагревании)

Синее (при нагревании)

 

Изолирование морфина из крови и мочи производили эдстраукционным методом. При этом 5 мл крови или мочи смешивали с 8 мл 40% раствора бисульфита натрия, добавляли 15% раствор (для крови) или концентрированную соляную кислоту (для мочи) до 10% содержания. Смесь нагревали на кипящей водяной бане в течение 30 мин, а затем охлаждали до комнатной температуры. К жидкости добавляли 50% раствор трихлоруксусной кислоты до 7% концентрации. После осаждения белковых веществ через 5—10 мин надосадочную жидкость отфильтровывали в делительную воронку, нейтрализовали раствором аммиака до рН 6,0—7,0, по универсальному индикатору. Жидкость насыщали кристаллическим бикарбонатом натрия (0,5 г на 30 мл жидкости) и экстрагировали смесью бутанол—хлороформ 1:9 (3×20 мл×5 мин). Бутанольно-хлороформные извлечения фильтровали через бумажный фильтр с безводным сульфатом натрия. Фильтрат выпаривали в двух фарфоровых чашках при температуре не выше 40°. Остатки растворяли в небольшом объеме смеси бутанол—хлороформ 1:9, раствор в виде пятен наносили на хроматографические пластинки 13×18 см со слоем силикагеля КСК (120 меш) и хроматографировали в системе этилацетат—метанол—аммиак 17:2:1. Одновременно на каждую пластинку в 3 пятна наносили по 10 мкг растворов-метчиков (морфин, героин и кодеин). Время хроматографирования 60—80 мин. После подсушивания хроматограммы проявляли: одну — реактивом Марки, вторую — реактивом Фреде, нанося реактивы равномерным слоем. Хроматографические пластинки с исследуемым остатком проявляли методом наложения на пластинки с реактивами Марки и Фреде и отмечали границы проявившихся зон и окрашиваний.

Результаты опытов представлены в табл. 2.

Граница обнаружения морфина составляет 15 мкг в 5 мл крови и 10 мкг в 5 мл мочи. Разработанная методика позволяет извлекать 83% морфина из крови и 71,3% из мочи.

Разработанный метод изолирования, обнаружения и определения морфина в биологических жидкостях был проверен в опытах на животных.

Таблица 2

Границы обнаружения морфина в 5 мл крови и мочи

Добавлено морфина (в мкг)

Кровь

Моча

Rf

реактив
Марки

реактив
Фреде

Rf

реактив
Марки

реактив
Фреде

200

0,35

0,30

0,30

0,25

0,22

0,19

+++

+++

+++

+++

+++

+++

+++

+++

+++

+++

+++

+++

0,28

0,32

0,30

0,27

0,24

0,29

+++

+++

+++

+++

+++

+++

+++

+++

+++

+++

+++

+++

Контроль

н

н

н

н

50

0,32

0,32

0,30

0,30

0,32

0,20

+++

+++

+++

+++

+++

+++

+++

+++

+++

+++

+++

+++

0,29

0,30

0,28

0,32

0,27

0,30

+++

+++

+++

+++

+++

+++

+++

+++

+++

+++

+++

+++

Контроль

н

н

н

Н

25

0,17

0,16

0,13

0,17

0,18

0,17

++

+++

++

++

+++

+++

++

+++

++

++

+++

+++

0,18

0,20

0,24

0,27

0,22

0,24

+++

+++

+++

+++

+++

+++

+++

+++

+++

+++

+++

+++

Контроль

н

н

н

н

15

0,13

0,10

0,12

0,11

0,16

0,15

++

+--

++

++

+-

++

-+

+-

++

++

+-

++

0,10

0,15

0,13

0,12

0,18

0,20

++

++

+-

++

++

++

++

++

+-

++

++

++

Контроль

н

н

Н

Н

10

-

 

 

 

 

 

-

-

+-

-

-

+-

-

-

+-

-

-

+-

0,20

0,16

0,15

0,17

0,22

0,19

++

+-

+-

++

++

++

++

+-

+-

++

++

++

Контроль

н

н

н

Н

Обозначения: (+++) — резко положительная реакция; (++) — положительная реакция; (+-) — слабо положительная реакция; (-) — отрицательная реакция; Н — не найдено.

Трем кроликам внутримышечно ввели раствор хлоргидрата морфина 2 мг/кг, 5 мг/кг и 10 мг/кг веса (из расчета на основание). Перед введением и через 30, 60 и 240 мин после введения морфина у животных отбирали по 5 мл крови. От всех кроликов собирали мочу в течение 4 сут. Мочу и кровь исследовали по описанной выше методике, а количественное определение морфина производили по методике, предложенной В.Ф. Крамаренко (1966). Результаты опытов, представленные в табл. 3, подтвердили достаточно высокую чувствительность экстракционно-хроматографической методики обнаружения морфина в моче.

Таблица 3

Исследование крови и мочи 3 кроликов после внутримышечного введения морфина

Введено морфина (в мг/кг)

Кровь

Моча

Кровь

Моча

Кровь

Моча

минуты

сутки

минуты

сутки

минуты

сутки

30

60

240

1

2

4

30

60

240

1

2

4

30

60 I240

1

2

4

2,0

5,0

10,0

++

 

 

++

 

 

+-

 

 

0,54 мг

 

 

 

 

 

 

 

++

 

 

++

 

 

++

 

 

1,4 мг

 

 

 

 

 

 

 

+-

 

 

++

 

 

++

 

 

3,6 мг

 

 

 

 

Rf

0,16—0,17

0,12

0, 19 — 0,22

0,12

0,07

0,07

Контроль

Не найдено

Не найдено

Не найдено

Обозначения: (++) — морфин обнаружен на хроматограммах реакциями Марки и Фреде, результат реакций положительный; (+-) — морфин обнаружен на хроматограммах реакциями Марки и Фреде, результат реакций слабо положительный; (-) — результат реакции отрицательный.

Эксперименты, проведенные на животных, указывают на целесообразность определения морфина при исследовании суточного объема мочи, а не крови.

Выводы

  1. Разработан метод изолирования, обнаружения и определения морфина в крови и моче человека. Граница обнаружения морфина составляет 15 мкг в 5 мл крови и 10 мкг в 5 мл мочи.
  2. Отделение морфина от других алкалоидов опия и производных фенотиазинового ряда обеспечивается хроматографированием в фиксированном слое силикагеля КСК.
  3. Полученные экспериментальные данные проверены в опытах на животных.

 

1 1 мл 10% раствора платинохлористоводородной кислоты смешивали в мерной жолбе емкостью 50 мл с 25 мл 4% раствора йодида калия и доводили водой до метки.

похожие статьи

Судебно-медицинская оценка токсичности опиоидов у взрослых и детей с персистирующей болью / Абузарова Г.Р., Гусева О.И., Ковалев А.В., Кумирова Э.В., Невзорова Д.В., Франк Г.А., Шигеев С.В. — 2015.

Морфологическая диагностика токсического воздействия курительных смесей в случаях смертельных отравлений пирролидинвалерофеноном / Джуваляков П.Г., Збруева Ю.В., Кабакова С.С., Богомолов Д.В., Букешов М.К. // Судебно-медицинская экспертиза. — М., 2017. — №4. — С. 18-20.

Отравления наркотиками и психодислептиками: характеристика структуры по видам токсикантов (по данным хабаровского центра острых отравлений) / Щупак А.Ю., Юхно В.В. // Избранные вопросы судебно-медицинской экспертизы. — Хабаровск, 2017. — №16. — С. 96-97.

Определение свинца в биологическом материале дитизонатным методом / Крылова А.Н. // Судебно-медицинская экспертиза. — М., 1968. — №4. — С. 28-33.

Сравнительная оценка методов выделения ареколина и кондельфина из биологического материала / Бисенбаев Э.М., Крамаренко В.Ф. // Судебно-медицинская экспертиза. — М., 1968. — №4. — С. 26-28.

Определение малых количеств ацетальдегида газо-жидкостной хроматографией (Сообщение I) / Колдаев А.А. // Судебно-медицинская экспертиза. — М., 1968. — №4. — С. 24-26.