Определение групп гаптоглобина дискэлектрофорезом в акриламидном геле

/ Старостин Н.Н.  // Судебно-медицинская экспертиза. — М., 1974 — №3. — С. 21-22.

Старостин Н.Н. Определение групп гаптоглобина дискэлектрофорезом в акриламидном геле

УДК 340.624.4:616.153.963.1

Кафедра судебной медицины (зав. — проф. П.Г. Арешев) Крымского медицинского института, Симферополь

Определение типов гаптоглобина дискэлектрофорезом в акриламидном геле. Старостин Н.Н. Суд.-мед. эксперт., 1974, № 3, с. 21.

Предложены некоторые изменения методики дискэлектрофореза, упрощающие подготовительные операции, значительно сокращающие затрачиваемое время и дающие более демонстративные результаты.

 

HAPTOGLOBIN TYPING BY DISC ELECTROPHORESIS IN ACRYLAMIDE GEL

N. N. Starostin

Some improvements of the technique permitting considerable accelerating of the proceeding by the simplifying of the preparatory operations are proposed. The results are more demonstrative as compared with those obtained in starch gel.

ссылка на эту страницу

Электрофорез в акриламидном геле получил широкое распространение благодаря ряду преимуществ. Являясь синтетическим препаратом, акриламидный гель имеет постоянный химический состав, прозрачен, пригоден как для щелочных, так и кислых буферных систем, имеет большую фракционирующую способность.

Электрофорезу в акриламидном геле посвящен ряд работ (Ю.Я. Гофман, 1965, 1967; М.О. Тер-Маркарьян, Э.Г. Ларский, 1966; Gervais и соавт., 1967, и др.).

Наиболее результативным вариантом вертикального электрофореза в акриламидном геле, и в частности при определении групп гаптоглобина, является дискэлектрофорез (Г. Маурер, 1971; Hilgermann, и др.).

В методическом письме Главной судебно-медицинской экспертизы Министерства здравоохранения СССР — «Определение типов гаптоглобина в жидкой крови» (1970) — говорится только о крахмальном геле. Практика показала большую трудоемкость подготовительного гидролиза крахмала. Применение акриламидного геля сводит подготовительные операции до минимума.

Материал и методика. Кровь центрифугировали, полученную сыворотку соединяли с гемоглобином в обычных соотношениях. Применяли серийный прибор для дискэлектрофореза модели 69, «РЕАНАЛ» (ВНР).

Основные растворы. Раствор № 1: 1н. НСl — 48 мл, триса — 36,6 г, тетраметил-этилен-диамида — 0,23 мл, дистиллированной воды до 100 мл при рН 8,9 (для получения 1 н. НСl можно использовать «Фиксанал» с 0,1 г эквивалентным раствором НСl, доводя содержимое ампулы водой до 100 мл). Раствор № 2: акриламида — 28 г, метилен-бис-акриламида — 0,735 г, дистиллированной воды до 100 мл. Раствор № 3: сахарозы — 40 г, 0,01% раствора бромфенолового синего до 100 мл. Раствор №4: персульфата аммония — 0,14 г, дистиллированной воды до 100 мл. Раствор № 5 (электродный буфер): триса — 4 г, глицина — 28,8 г, дистиллированной воды до 1000,0 мл при рН 8,3; перед употреблением электродный буфер надо разбавить в 10 раз дистиллированной водой.

Растворы можно длительное время хранить в условиях холодильника; раствор персульфата аммония готовят каждые 10—14 дней.

Полиакриламид — полимер акриламида и метилен-бис-акриламида, он полимеризуется при добавлении катализатора, для чего необходимо приготовить из основных растворов смесь из 1 объема раствора № 1, 2 объемов раствора № 2, 4 объемов дистиллированной воды и 4 объемов раствора № 4. Таким образом получают 6% «мелкопористый гель». Общий объем полученной смеси необходимо приготовить из расчета 2,5 мл на каждую стеклянную трубку, прилагаемую к прибору, что позволяет одновременно исследовать 12 объектов сывороток.

На специальном штативе, входящем в комплект к прибору, укрепляют исходное количество стеклянных трубок, в которые вводят заданное количество геля шприцем с иглой, опущенной на дно штатива. Для устранения мениска и создания безвоздушности на гель осторожно, не смешивая, наслаивают 0,2—0,3 мл дистиллированной воды. Хорошие результаты дает использование эфира вместо воды: это значительно упрощает наслаивание и исключает разбавление геля. Через 20—30 мин, как правило, наступает полимеризация, при этом граница между гелем и дистиллированной водой (или эфиром, который наслаивают до края трубки) становится заметной. После получения геля резиновые прокладки и конусные кольца удаляют, трубки на штативе фиксируются за счет резьбовых зажимов, обеспечивающих свободное извлечение трубок, из которых энергичным встряхиванием удаляют воду (или эфир). Исследуемую сыворотку с гемоглобином в количестве 0,1 мл соединяют с 0,9 мл раствора № 3 и тщательно перемешивают. Необходимое количество трубок (имеющих заводскую нумерацию) с гелем герметично укрепляют в приборе с помощью резиновых прокладок, конусных колец и резьбовых зажимов так, чтобы незаполненные концы выступали в катодную камеру на одном уровне (2—2,5 см); если необходимо применить их в меньшем количестве, то в неиспользованных гнездах герметично укрепляют пустые трубки на максимальную высоту. Удобнее закрывать неиспользованные гнезда пробками. 0,1 мл сыворотки с раствором сахарозы вводят в трубку на гель и, не допуская смешивания, наслаивают рабочий раствор электродного буфера до края трубки. Буферный раствор с успехом можно заменить эфиром. Затем в катодную и анодную камеры с встроенными угольными электродами заливают по 1 л рабочего буферного раствора и электроды присоединяют к источнику постоянного тока.

Проведение электрофореза. Примерно первые 0,5 ч сила тока не должна превышать 2 мА, затем ее увеличивают до 3—4 мА на каждую трубку с гелем и продолжают электрофорез не более 1,5 ч. За миграцией белка можно ориентировочно следить по уровню четкого диска бромфенолового синего, который имеет наибольшую скорость передвижения.

Извлечение и окраска геля. Предварительно приготовленный 0,2% раствор бензидина в 10% уксусной кислоте разливают в пронумерованные пробирки, соответственно количеству гелевых столбиков (их извлекают, обводя затупленной иглой длиной 10 см со шприцем под давлением воды, вводимой между трубочкой и гелем по спирали). Каждый в отдельности объекты помещают в пробирки с бензидиновоуксусным раствором, добавляют по 0,1 мл пергидроля, тщательно перемешивают, при этом через 1— 2 мин появляются лазурно-голубые кольца фракций гаптоглобина. Затем, не допуская перекрашивания, каждый столбик промывают дистиллированной водой и заливают 7% раствором уксусной кислоты. По мере хранения цвет фракций гаптоглобина переходит в темно-коричневый.

Фотографирование и консервирование объектов. Фотографировать лучше с прямым подсвечиванием через матовое стекло, держа гелевый столбик в положении, близком к вертикальному, в пробирке с 7% уксусной кислотой. Мы применяли портативную фотоустановку типа РДУ с пленкой «микрат»-300. Гель можно также в течение длительного времени хранить в глицерине. Столбики легко высушиваются, но в воде довольно быстро принимают первоначальный вид.

Обсуждение методики. В приготовление, соотношение растворов и методику работы с прибором, изложенные в инструкции, прилагаемой к прибору, внесены изменения, упрощающие метод и сокращающие время исследования: вместо введения бромфенолового синего в электродный буфер краситель добавляли к сахарозе; снизили концентрацию акриламидного геля до 6%; исключили применение «крупнопористого» и «стартового» геля; использовали эфир для полимеризации геля и для предотвращения смешивания буферного раствора с сахарозой; упростили введение сыворотки; при указанной силе тока исключили применение холодильника.

Результаты исследований 100 образцов сывороток с известными группами гаптоглобина совпали, причем фракции гаптоглобина выявлялись более четко, чем при других несущих средах.

похожие материалы в каталогах

Судебно-биологические исследования

похожие статьи

К вопросу об использовании макроглобулинов крови человека при судебно-медицинском исследовании трупа / Яковлев Д.Ю. // Вестник судебной медицины. — Новосибирск, 2018. — №4. — С. 16-18.

К анализу и интерпретации результатов при установлении видовой принадлежности биологических объектов (случай из практики) / Кулясова Н.А., Недолуга Н.О. // Избранные вопросы судебно-медицинской экспертизы. — Хабаровск, 2018. — №17. — С. 143-145.

Дифференциация в смешанных пятнах антигена А выделений от антигена А крови при помощи лектина / Потапов М.И. // Судебно-медицинская экспертиза. — М., 1968. — №3. — С. 21-26.

Сравнительное исследование антигенов системы АВ0 в слюне, сперме и в секрете влагалища / Масис Т.М. // Судебно-медицинская экспертиза. — М., 1968. — №2. — С. 21-27.

Выявление в сыворотках крови людей антител к антигенам системы Gm / Резникова М.Н., Баринова Л.И., Соловьева Н.А., Башлай А.Г., Моргулис Н.Б. // Судебно-медицинская экспертиза. — М., 1968. — №1. — С. 35-38.