Возможность обнаружения семенных пятен без нахождения в них сперматозоидов (сообщение I)

/ Гладких А.С. Гадакчян Д.Г.  // Судебно-медицинская экспертиза. — М., 1974 — №3. — С. 28-30.

Гладких А.С., Гадакчян Д.Г. Возможность обнаружения семенных пятен без нахождения в них сперматозоидов (сообщение I)

УДК 340.624.4

Возможность обнаружения семенных пятен без нахождения в них сперматозоидов (Сообщение 1). Гладких А.С. и Гадакчян Д.Г. Суд.-мед. эксперт., 1974, № 3, с. 28.

Предложен принципиально новый метод, основанный на органоспецифичности ферментов и выявлении в пятнах спермы особого изофермента ЛДГ, присущего только семенной плазме. Иллюстрация 1.

 

A POSSIBILITY OF DETECTING SEMINAL STAINS WITHOUT FINDING SPERMATOZOA

A. S. Gladkikh, D. G. Gadakchyan

Isoenzyme spectre of lactate dehydrogenase (LDH) was studied in spermatozoa, seminal plasma, red blood cells, blood serum, saliva and sweat by starch gel electrophoresis. Liquid material, experimental stains of blood, semen, saliva and sweat, and extracts of stains of blood mixed with semen were studied alike. The activities of LDH isoenzymes in blood and semen were high, allowing to detect LDH isoenzyme spectre in stains of blood and semen. A peculiar additional component of LDH activity was found in seminal plasma. It was absent in spermatozoa, red blood cells, blood serum, saliva, and sweat. This component allows todiagnose the seminal origin of a stain where spermatozoa are lacking.

ссылка на эту страницу

В последние годы интерес исследователей привлекла молекулярная гетерогенность биологически активных веществ и в первую очередь ферментов в различных тканях и органах. Речь идет о тканевой и органной специфичности ферментов. Учитывая, что сперма имеет исключительно сложный белковый состав и является одной из самых активных в биологическом плане жидкостей организма, мы исследовали молекулярную гетерогенность некоторых ее ферментов в аспекте их специфичности для данного экскрета.

Исследования Boyer (1963), Beckman и Regan (1964), Lundin и Allison (1965), Beckman, Björling и Christodoulou (1966), а также собственные наблюдения свидетельствуют о высокой органной и тканевой специфичности указанных выше ферментов. Markert и Мöller (1959) выявили 5 изоферментов лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в различных тканях, онтогенетические и органоспецифические различия в электрофоретически разделенных компонентах фермента. Было также отмечено различное отношение 5 изоферментов ЛДГ-1—ЛДГ-5 (по уменьшающейся подвижности к аноду) в некоторых органах и тканях человека. Blanco и Zinkham (1963) наблюдали дополнительный компонент ЛДГ-активности на фореграммах гомогенатов яичек. Davidson и соавт. (1965) также наблюдали в электрофоретически разделенных образцах спермы дополнительный компонент ЛДГ, названный ими «Х»-компонентом.

Мы изучали изоферменты ЛДГ в сперматозоидах и семенной плазме, сравнивая их с изоферментами ЛДГ крови и некоторых других выделений. Исследовали также возможность выявления изоферментов ЛДГ в экспериментальных пятнах крови и спермы.

Изоферменты ЛДГ заинтересовали нас еще и потому, что до сих пор этот фермент совершенно не изучен в судебно-медицинском аспекте. Это связано, по-видимому, с тем, что в данной ферментной системе отсутствует генетически обусловленный полиморфизм. Атипичные варианты ЛДГ в эритроцитах человека встречаются редко.

Материал и метод. Исследовали сперму из семенных пузырьков трупов и сперму живых мужчин (20 образцов), трупную кровь и кровь живых лиц (20 образцов), а также слюну и пот от 10 лиц. Электрофоретически исследовали спермолизаты, семенную плазму без сперматозоидов, сыворотку крови и гемолизаты эритроцитов, слюну, а также вытяжки из экспериментальных пятен крови, спермы, слюны, пота и вытяжки из смешанных пятен крови и спермы. Спермолизаты готовили следующим образом: цельную сперму ценрифугировали при 5000 об/мин 25—30 мин, надосадочную жидкость (семенную плазму) отделяли и осадок сперматозоидов 5 раз отмывали физиологическим раствором. Спермолизаты готовили из отмытых сперматозоидов путем добавления к ним дистиллированной воды в отношении 1:1 с последующим замораживанием, оттаиванием и центрифугированием. Экспериментальные пятна крови и выделений приготовляли на марле и исследовали на 1—10-й день. Проводили горизонтальный электрофорез в крахмальном геле 16—18 ч при градиенте напряжения 5 В/см в условиях холодильника. Использовали трис-ЭДТА — Н3ВО3 буферную систему по Nance и сотр. (1963). Для выявления ЛДГ-активности использовали инкубационную смесь следующего состава: 100 мл 0,2 М фосфатного буфера, рН 7,4, 10 мл 1 М раствора лактата натрия, 10 мл 0,1 М раствора хлористого натрия, 10 мл 0,3 М раствора хлористого магния, 20 мг НАД (никотинамидадениндинуклеотид), 20 мг НСТ (нитросиний тетразолевый), 1 мг ФМС (феназинметосульфат). Инкубацию крахмального геля проводили в термостате при 37° в течение 1 ч, после чего учитывали результаты.


Фореграмма лактатдегидрогеназы крови и
выделений.
Сверху вниз: спермолизат, гемолизат,
гемолизат, семенная плазма, сыворотка
крови, вытяжка из пятна пота,
сыворотка крови» слюна.

Важное значение имеет подбор оптимальных условий электрофореза и выявление ферментативной активности. Для четкого разделения необходимо использовать плотный (15%) крахмальный гель, проводить электрофорез при низкой (20—25 мА) силе тока в течение 16—18 ч в условиях холодильника. Стартовые щели не должны располагаться ближе 10 см от катодного края геля. Используя для выявления ЛДГ-активности метод Markert и Мöller (1959), мы значительно увеличили по сравнению с оригиналом содержание в растворе хлористого магния, являющегося активатором ЛДГ, в инкубационной среде с 0,005 М до 0,3 М. Вместо рекомендованного тетразолевого красителя (МТТ) использовали НСТ, который не придавал неблагоприятного синего фона фореграммам ЛДГ.

Результаты исследования. Полученные изоферменты ЛДГ представляют собой ряд параллельных сиренево-фиолетовых полос различной интенсивности, возникающих в результате реакции с образованием нерастворимых солей формазана. Компоненты ЛДГ-1—ЛДГ-4 имеют анодную подвижность, а ЛДГ-5 мигрирует к катоду.

Наибольшей ферментативной активностью обладали гемолизаты эритроцитов, сыворотка крови и семенная плазма без сперматозоидов (отсутствие сперматозоидов подтверждалось микроскопически). Изоферментный спектр ЛДГ эритроцитов, сыворотки крови и семенной плазмы имел высокую активность, но был различным (см. рисунок на вклейке).

Гемолизаты эритроцитов демонстрировали 3 четких компонента: ЛДГ-1, ЛДГ-2 и ЛДГ-3, которые имели почти одинаково высокую активность. Компоненты ЛДГ-4 и ЛДГ-5 в эритроцитах отсутствовали.

Сыворотка крови демонстрировала 5 компонентов ЛДГ, причем наиболее интенсивны были ЛДГ-1, ЛДГ-2 и ЛДГ-3. В некоторых образцах катодный компонент ЛДГ-5 имел высокую ферментативную активность и не уступал по интенсивности окрашивания ЛДГ-1 — ЛДГ-3.

Изоферментный спектр ЛДГ семенной плазмы имел характерные особенности. Помимо 5 обычных компонентов (компоненты ЛДГ-1 и ЛДГ-5 имели низкую интенсивность окрашивания), он демонстрировал дополнительный компонент ЛДГ («Х»-компонент, по Davidson и соавт., 1965), который мигрировал между ЛДГ-3 и ЛДГ-4.

Изоферментный спектр ЛДГ спермолизатов, также как и гемолизатов эритроцитов, характеризовался только 3 компонентами — ЛДГ-1, ЛДГ-2 и ЛДГ-3, однако активность их (особенно ЛДГ-1) была гораздо ниже. На фореграммах видно, что дополнительный «Х»-компонент фермента присущ не сперматозоидам, а семенной плазме. Наши исследования показали отсутствие существенной разницы в спектрах ЛДГ крови и спермы, взятых у живых лиц и у трупов. В некоторых случаях можно было отметить чуть меньшую активность ЛДГ в трупном материале.

В слюне выявлялись два слабоинтенсивных компонента — ЛДГ-2 и ЛДГ-3, и в ряде образцов — ЛДГ-5 с крайне низкой активностью. В образцах слюны, длительное время хранившихся в холодильнике, компонент ЛДГ-5 был выражен сильнее.

Из пятен спермы, крови, слюны, пота и смешанных пятен крови и спермы готовили вытяжки, которые также подвергли электрофоретическому исследованию (измельченный кусочек пятна размером 1 см2 заливали без избытка физиологическим раствором и экстрагировали в холодильнике 20—24 ч).

В пятнах крови четко выявлялись все 5 компонентов, причем быстро мигрирующие ЛДГ-1, ЛДГ-2 и ЛДГ-3, присущие как эритроцитам, так и сыворотке крови, были выражены несколько сильнее, чем ЛДГ-4 и ЛДГ-5.

В пятнах спермы выявлялись 6 компонентов — слабовыраженные ЛДГ-1 и ЛДГ-5 и значительно более интенсивные ЛДГ-2, ЛДГ-3, ЛДГ-4 и характерный для семенной плазмы «X».

В смешанных пятнах крови и спермы также отчетливо выявлялись 6 компонентов. Компоненты ЛДГ-1, ЛДГ-2 и ЛДГ-3 окрашивались очень интенсивно, ЛДГ-4, ЛДГ-5 и «X» семенной плазмы — несколько слабее.

Только в очень свежих пятнах слюны мы смогли выявить 2 компонента — ЛДГ-2 и ЛДГ-3 с очень низкой активностью. Уже на 4—5-й день в пятнах слюны изоферменты ЛДГ не выявлялись.

Изоферментный спектр ЛДГ в свежих пятнах пота был еще более скудным — только в половине исследованных образцов можно было обнаружить единственный компонент ЛДГ-активности, крайне слабо окрашенный, мигрирующий со скоростью ЛДГ-2. Во всех исследованных пятнах пота давностью свыше 5 дней ЛДГ-активность отсутствовала.

Сравнение активности изоферментов ЛДГ крови и спермы в пятнах давностью 1—2 дня и 10 дней показало полную тождественность. По-видимому, активность фермента в крови и сперме настолько велика, что на фореграммах трудно визуально уловить изменение интенсивности компонентов ЛДГ за небольшой срок. Эти данные обнадеживают. По-видимому, можно будет легко выявлять спектр ЛДГ и при значительно большей давности. Окончательному решению этого вопроса будут способствовать исследования активности изоферментов ЛДГ в более старых пятнах крови и спермы.

Выявление в пятнах спермы особого компонента ЛДГ, присущего только семенной плазме, открывает принципиально новую возможность установления семенного происхождения пятен: без обнаружения в них сперматозоидов. Ценность метода состоит в том, что он основывается на характерных особенностях изоферментов ЛДГ семенной плазмы, постоянно присутствующих в пятнах спермы, в то время как сперматозоиды могут быть разрушены или полностью отсутствовать. Метод, по-видимому, найдет применение при исследовании загрязненных пятен спермы, при азооспермии и олигоспермиях, а также при исследовании смешанных пятен спермы и крови, в которых нахождение сперматозоидов бывает весьма затруднительным. Он позволит впервые практически использовать органо- и тканеспецифичность ферментов для решения важного вопроса судебно-медицинского исследования вещественных доказательств — установления пятен спермы без выявления сперматозоидов.

Дальнейшие исследования в этой области, очевидно, должны быть направлены в первую очередь на изучение возможности выявления особенностей изоферментного спектра ЛДГ в старых пятнах спермы и в патологически измененном эякуляте, в органах, тканях и секретах с тем, чтобы окончательно решить вопрос о строгой специфичности так называемого «Х»-компонента ЛДГ для семенной плазмы.

похожие материалы в каталогах

Обнаружение и исследование спермы

похожие статьи

Выявление спермина в пятнах спермы путем электрофореза на бумаге / Буреш Л. // Судебно-медицинская экспертиза. — М., 1968. — №3. — С. 46-47.

О применении сока из клубней картофеля для обнаружения спермы на вещественных доказательствах / Тюрникова Ф.В. // Судебно-медицинская экспертиза. — М., 1968. — №2. — С. 27-28.

О реакции на сперму с соком из клубней картофеля / Инглез О.В. // Судебно-медицинская экспертиза. — М., 1968. — №1. — С. 49-51.

К вопросу о реакции человеческой спермы с картофельным соком / Барсегянц Л.О. // Судебно-медицинская экспертиза. — М., 1967. — №3. — С. 35-39.

Установление наличия и видовой принадлежности человеческой спермы при помощи некоторых растительных экстрактов / Барсегянц Л.О. // Судебно-медицинская экспертиза. — М., 1967. — №1. — С. 34-36.