О сохраняемости производных барбитуровой кислоты в печени трупа

/ Швайкова М.Д. Изотов Б.Н. Кокшарова Н.В. Метелева Е.В. Хомов Ю.А.  // Судебно-медицинская экспертиза. — М., 1974 — №4. — С. 33-36.

Швайкова М.Д., Изотов Б.Н., Кокшарова Н.В., Метелева Е.В., Хомов Ю.А. О сохраняемости производных барбитуровой кислоты в печени трупа

УДК 340.67:616.36-099:547.854.51-079.6

Кафедра токсикологической химии (зав. — проф. М.Д. Швайкова) I Московского медицинского института

Производные барбитуровой кислоты хорошо сохраняются и могут быть надежно идентифицированы и определены в загнившем материале, хранившемся от 1 до 6 мес. Таблиц 3. Иллюстрация 1.

 

A STUDY ON THE CONSERVATION OF BARBITURIC DERIVATIVES IN THE CADAVERIC LIVER

M. D. Shyaikova, B. N. Izotov, N. V. Koksharova, E. V. Meteleva, Y. A. Komov

A possibility of reliable identification and estimation of various barbituric derivatives in decomposed material dating up to 6 months is demonstrated.

ссылка на эту страницу

В практике судебно-химических экспертиз нередки случаи исследования загнившего биологического материала. Наше сообщение касается сохраняемости производных барбитуровой кислоты в трупе человека, а также влияния продуктов гнилостного разложения на их обнаружение и определение при различных сроках хранения.

Ряд авторов (А.И. Костякова; Н.А. Горбачева и А.Ф. Рубцов; Algeri, и др.) отмечали, что барбитураты достаточно хорошо сохраняются в трупном материале. Однако при анализе загнившего биологического материала Jackson и Finkle обнаружили вещества, получившие название «псевдобарбитураты», которые обладают способностью поглощать в той же области спектра, что и барбитураты, создавая помехи при спектрофотометрическом определении. «Псевдобарбитураты» найдены в печени, почках, мышцах, крови, моче (Nickolls; Umberger, и др.). Для отделения барбитуратов от сопровождающих компонентов чаще всего используют хроматографию в тонком слое сорбента.

Возможность определения барбитуратов при сроках хранения биологического материала от 1 до 6 мес мы установили на примере наиболее употребительных соединений: барбитала, фенобарбитала, барбамила этаминал-натрия. Объектом исследования выбрали печень.

Методика. Печень измельчали. К 100 г средней пробы прибавляли 40 мг барбитурата в водном растворе и оставляли в колбах с резиновыми пробками в теплом, проветриваемом помещении при 18—25° сроком на 1 и 6 мес. Одновременно ставили контрольные опыты (печень без барбитуратов). Объекты исследовали параллельно с пробами, содержащими барбитурат. По истечении указанного времени объект заливали 200 мл дистиллированной воды, подкисленной водным раствором щавелевой кислоты до рН 200 по универсальному индикатору и при частом перемешивании настаивали при комнатной температуре, затем переносили в стакан для центрифугирования емкостью 500 мл и центрифугировали 30 мин. при 3,5 тыс. об/мин. Центрифугат процеживали через ватный тампон, смоченный дистиллированной водой, в делительную воронку и экстрагировали при рН 2,0 хлороформом (20, 15, 15 мл) каждый раз по 5 мин. Образующуюся эмульсию разрушали центрифугированием (4,5—5 тыс. об/мин, 5 мин). После разделения фаз хлороформное извлечение, содержащее барбитурат, реэкстрагировали 0,1 н. раствором едкого натрия (1 часть на 2 части органической фазы) 5 мин. После центрифугирования водную фазу отсасывали пипеткой, подкисляли соляной кислотой до рН 2,0 и дважды экстрагировали хлороформом по 20 мл (по 5 мин). Хлороформные вытяжки объединяли и доводили хлороформом до 50 мл.


Хроматограмма барбитуратов, выделенных
из биологического материала.
Ф — фенобарбитал; Б — барбитал;
Бм — барбамил; Э — этаминал-натрия;
1, 2 — зоны барбитуратов в исследуемом
извлечении, 3, 4 — элюируемые участки
сорбента, соответствующие обнаруженным
барбитуратам.

2 мл хлороформного извлечения испаряли под струей теплого воздуха примерно до 0,1 мл и количественно наносили на стартовую линию хроматографической пластинки с закрепленным слоем силикагеля КСК1 (см. рисунок). На расстоянии 1 см от первой точки на вторую наносили последовательно по 0,02 мл (20 мкг) метаноловых растворов барбитала, фенобарбитала, барбамила и этаминал-натрия. В точки 3 и 4 наносили в виде полосы длиной около 1—1,5 см соответственно 10 мл (1/5 части) и 2,5—10 мл (1/20—1/5 части) хлороформного извлечения, предварительно упаренного до 0,1—0,2 мл. Все операции проводили количественно, несколько раз смывая остаток хлороформом. Хроматографировали 45 мин в камере, предварительно (20 мин) насыщенной парами растворителя в системе хлороформ — н-бутанол — 25% раствор аммиака (70:40:5). Длина пробега растворителя 10 см. После подсушивания до полного удаления органических растворителей часть пластинки в зонах хроматографирования точек 1 и 2 опрыскивали 0,02% раствором дифеншгкарбазона в хлороформе и водным раствором сульфата ртути2. В местах расположения барбитуратов наблюдались синие или красно-фиолетовые пятна, контуры их отмечали и вычисляли Rf (барбитал 0,52—0,57, фенобарбитал 0,40—0,42, барбамил 0,75, этаминал 0,78). Параллельно обнаруженным пятнам прибором для вакуум-экстракции (Richelmann) снимали со второй половины пластинки зоны сорбента (2×2 см) и элюировали из точки 3—5 мл смеси эфира и этанола (1:1), а из точки 4—боратным буфером рН 10,0 дважды по 10 мл. Элюировали под вакуумом со стекляннным фильтром № 4.

В спирто-эфирном элюате барбитураты выявляли микрокристаллическими реакциями выделения кислотной формы и получения йодидных комплексов.

Порции водного элюата объединяли и доводили боратным буфером в мерной колбе до 25 мл (при D>1 разводили). Спектрофотометрировали в области 220—300 нм, получая характерные для барбитуратов спектры с максимумами в области 238—240 нм. Для количественного определения измеряли разность оптических плотностей при 239 нм в щелочном (рН 10,0) и кислом (рН 2,0: его создавали добавлением в кювету 1 капли концентрированной соляной кислоты) растворах, в 1 см кварцевой кювете на спектрофотометре СФ-4А. Концентрацию рассчитывали по уравнению закона Бера.

D = E1%1 см × 1 × с

 

Таблица 1

Результаты определения барбитуратов (в %) в трупе (среднее из 5 определений)

Барбитурат Срок хранения
1 мес 6 мес
Барбитал 1,89±0,29 2,84±0,36
Фенобарбитал 14,27 ±2,84 14,98±0,72
Барбамил 23,04±2,95 21,22±1,35
Этаминал-натрий 21,01±2,03 20,08±0,51

Примечание. Опыты с барбитуратами, добавленными к печени, хранившейся до 1 нед, дали следующие результаты: барбитал — 2,79±0,33: фенобарбитал—13,22±1,52; барбамил — 23,92±2,43; этаминал-натрий — 24,82± ±0,87.

 

Удельные показатели поглощения E1%1 см определяли заранее, измеряя оптическую (плотность растворов барбитуратов в боратном буфере с известной концентрацией (от 2 до 20 мкг/мл) при указанных значениях рН и длине волны. С учетом разведения в буфере и взятой для определения аликвоты хлороформного извлечения рассчитывали количество изолированного барбитурата.

Таблица 2

Абсорбция при 239 нм посторонних примесей, экстрагируемых совместно с барбитуратами из гнилостного материала

Зона барбитурата Срок хранения
1 мес 6 мес
DpH 10,0 DpH 2,0 D диф. DpH 10,0 DpH 2,0 Вдиф.
Барбитал 0,011 0,011 0 0,002 0,002 0
Фенобарбитал 0,028 0,028 0 0,007 0,008 0,001
Барбамил0,0070,00700,0150,0150
Этаминал0,007 0,0070 0,0150,0150

Примечание. Опыты с барбитуратами, добавленными к печени, хранившейся до 1 нед, дали следующие результаты: барбитал — 2,79±0,33: фенобарбитал—13,22±1,52; барбамил — 23,92±2,43; этаминал-натрий — 24,82± ±0,87.

 

Изолирование подкисленной водой с последующей экстракционной и хроматографической очисткой дало возможность надежно идентифицировать и определять барбитураты в биологическом материале, хранившемся от 1 до 6 мес. Во всех опытах получили характерные для того или иного барбитурата Rf микрокристаллические реакции и спектральные характеристики в УФ-области. Данные количественного определения представлены в табл. 1.

Основным критерием возможности применения дифференциального спектрофотометрического определения барбитуратов, изолированных из биологического материала, является равенство абсорбции мешающих веществ в кислом (рН 2,0) и щелочном (рН 10,0) растворах при 239 нм. В этом случае посторонняя абсорбция математически уничтожается, если в уравнение закона Бэра вместо D подставить разницу в абсорбции элюатов при указанных значениях рН. Мы предварительно измеряли дифференциальную абсорбцию элюатов холостых проб биологического материала со сроком хранения 1 и 6 мес. Сочетание экстракционной и хроматографической очистки позволило полностью исключить поглощение посторонних примесей (табл. 2).

Из этих данных видно, что дифференциальная абсорбция посторонних примесей при работе с печенью практически равна нулю, что дает возможность надежно определять барбитураты спектрофотометрическим методом.

Таблица 3

Абсорбция при 239 нм посторонних примесей, экстрагируемых подкисленным спиртом из гнилостного материала

Зона барбитурата Срок хранения 6 мес
DpH 10.0 DpH 2.0 Dдиф.
Барбитал 0,079 0,042 0,037
Фенобарбитал 0,074 0,046 0,028
Барбамил 0,127 0,083 0,044
Этаминал 0,127 0,083 0,044

 

Попытка изолировать барбитураты из биологического материала со сроком хранения 6 мес подкисленным спиртом с последующей экстракционной и хроматографической очисткой привела к неудовлетворительным результатам.

Поглощение холостых проб было высоким и неодинаковым при различных значениях рН (10,0 и 2,0) (табл. 3), что исключало возможность спектрофотометрического определения.

Выводы

  1. Предложена методика определения барбитуратов (барбитала, фенобарбитала, барбамила, этаминала) в загнившей печени с использованием извлечения подкисленной водой, последующей экстракционной и хроматографической очисткой, микрокристаллоскопией и дифференциальной спектрофотометрией в УФ-области.
  2. Барбитураты хорошо сохраняются, их можно надежно идентифицировать и определять в биологическом материале со сроками хранения от 1 до 6 мес.

 

1 На пластинки размером 9X12 см наносили смесь: 2,8 г силикагеля КСК (150— 200 меш), 0,17 г гипса и 7,5 мл 0,1 н. раствора борной кислоты, сушили при комнатной температуре на строго горизонтальной поверхности в течение суток.

2 Раствор сульфата ртути: 5,0 г HgO растворяют в 100 мл дистиллированной воды и 10 мл концентрированной серной кислоты и доводят до 250 мл.

похожие статьи

Особенности распределения 2,4- и 2,6-ди-трет-бутилгидроксибензола в организме теплокровных животных / Шорманов В.К., Цацуа Е.П., Асташкина А.П. // Судебно-медицинская экспертиза. — М., 2019. — №1. — С. 36-42.

Разработка методик изолирования, обнаружения и количественного определения алимемазина в биологических жидкостях лабораторных животных при острых отравлениях / Рыбасова А.С., Ремезова И.П., Любченко Д.А., Светличная Е.В., Авраменко Н.С. // Судебно-медицинская экспертиза. — М., 2019. — №1. — С. 31-35.

Разработка и валидация методики ферментативного гидролиза для изолирования токсических веществ из неокрашенных волос / Слустовская Ю.В., Стрелова О.Ю., Куклин В.Н. // Судебно-медицинская экспертиза. — М., 2019. — №1. — С. 24-30.

Химико-токсикологическое определение изониазида и метоклопрамида в объектах, используемых для отравления животных, и в биологических жидкостях / Чувина Н.А., Качкина М.А., Стрелова О.Ю. // Судебно-медицинская экспертиза. — М., 2018. — №6. — С. 33-38.

Влияние упаковки на сохраняемость летучих веществ / Исаков В.Д., Горбачева Т.В., Фокин М.Б., Сайгушкин Н.В. // Судебно-медицинская экспертиза. — М., 2018. — №5. — С. 31-34.

больше материалов в каталогах

Судебно-химические исследования