Подтверждение  11-нор-9-карбокси-∆9-ТГК в моче методом газовой хроматографии с масс-селективным детектором

Разработан  метод с использованием хромато-масс-спектрометрии для подтверждения и количественного определения 9-карбокси -11-нор-∆⁹-тетрагидроканнабинола в моче  для выполнения серийных анализов, с целью подтверждения положительных образцов мочи после предварительного скрининга иммунным методом на наличие каннабиноидов  Предложены оптимальные условия щелочного гидролиза  для пробоподготовки   биообъекта. В качестве предварительного метода скрининга на наличие 9-карбокси -11-нор-∆⁹-тетрагидроканнабинола предложен хорошо зарекомендовавший в рутинном химико-токсикологическом анализе метод флюоресцентно-поляризационного иммуноанализа.

В настоящее время всё чаще на исследования поступают объекты, такие как моча и кровь с целью обнаружения каннабиноидов.  Из практики Бюро судебно-медицинской экспертизы Министерства здравоохранения Московской области, в основном, это случаи, связанные с живыми лицами, задержанными с наркотиками, а также совершившими ДТП или просто задержанными с целью подтверждения или исключения состояния наркотического опьянения.

Под термином каннабиноиды подразумевается группа соединений, полученных из растения конопли, основнымм действующим и психоактивным компонентом которых является тетрагидроканнабинол (ТГК).

ТГК интенсивно метаболизируется и  с мочой выводится в неизменном виде лишь 1% ТГК. При курении метаболизм начинается в лёгких, а при приёме внутрь – орально – это происходит в печени. Через 72 часа после курения приблизительно 50% вдыхаемого ТГК выделится  (в виде метаболитов), а оставшиеся 50% распределяется в организме, в большей мере адсорбируется жировой тканью и медленно выделяется  в течение последующих дней. Выводится главным образом с мочой. Идентифицировано свыше 20 метаболитов ТГК. Главным метаболитом кислого характера является 11-нор-∆⁹-тетрагидроканнабинол-9-карбокси кислота, которая конъюгируется  и в виде моно и ди-глюкуронидов выделяется с мочой.

Анализ мочи имеет преимущество в детектировании метаболитов ТГК, в связи с тем, что основной метаболит можно обнаружить  на протяжении довольно продолжительного периода времени после употребления наркотика. Выделение  9-карбоки–ТГК после однократного потребления отличается от такового у хроников. После однократного потребления метаболит может быть определён  в моче в течение 1-3 дней, в то время как у хронических курильщиков метаболит  может быть определён в течение 3-х –4-х недель после последней дозы. Идентификация 11-нор-∆⁹-тетрагидроканнабинол-9-карбокси кислоты в моче считается наилучшим показателем потребления каннабиноидов. 

Результат предварительного метода анализа на каннабиноиды положителен,  если концентрация основного аналита 11-нор-∆⁹-тетрагидроканнабинол-9-карбокси кислоты  в моче  превышает  50 нг/мл – величину пороговой концентрации для предварительного  метода анализа.

В качестве предварительных методов  используют иммунные методы скрининга. Широко применяется радиоиммунный анализ (RIA), энзиматический иммунноанализ (EIA), флюоресцентно - поляризационный иммунноанализ, с дальнейшим подтверждением положительных проб более специфичным методом, таким как, газовая хроматография с масс-селективным детектором.

Рис.1 Метаболизм ТГК

В данной работе для предварительного скрининга применялся иммунный анализатор фирмы Abbot AxSYM  - ПФИА - флюоресцентно-поляризационный иммуноанализ.

Как  для анализа на каннабиноиды, так и для анализа на многие другие наркотические, лекарственные и психотропные препараты в моче, преимуществами использования данного анализатора являются:

• - стабильность калибровочных графиков
• - возможность получения полу-количественных результатов
• - получение мгновенных результатов на широкий спектр наркотических и психотропных веществ, что особенно важно в экстренных случаях
• - простота и надёжность в  использовании
• - отсутствие пробоподготовки и органических растворителей.

Использования этого анализатора  в рутинном анализе образцов мочи на наркотические и психотропные вещества значительно снижает трудозатраты.

Метод ГХ-МС в наши дни является основным аналитическим методом для подтверждения  и количественного определения наркотических веществ.

Для выполнения серийных анализов, с целью подтверждения положительных образцов после предварительного скрининга методом ПФИА на наличие каннабиноидов,  был разработан  ГХ-МС метод для подтверждения и количественного определения 9-карбокси- ТГК на уровне пороговой концентрации  15 нг/мл (для подтверждающего метода).

Целью данного исследования была разработка  надёжного, высоко чувствительного, воспроизводимого, не дорогого и точного метода. Стоит отметить, что до этого метод ТСХ использовался для конечного подтверждения 11-нор-∆⁹-тетрагидроканнабинол-9-карбокси кислоты в моче.

Таблица 1.  Преимущества и недостатки двух методов, используемых в качестве подтверждающих

Количественное определение и интерпретация результатов при использовании ГХ-МС метода анализа требует использование внутренних стандартов – стандартов, добавленных к образцу до процедуры экстракции. Внутренний стандарт должен иметь  сходства с “исследуемым аналитом”. Он должен экстрагироваться, дериватизироваться и анализироваться  при тех  же условиях и хорошо разделяться во время хроматографической процедуры. При количестенном определении методом ГХ-МС наиболее широко используют дейтерированные  аналоги, но в основном только для количественного определения в крови, т.к.  они очень дороги.

Количественный метод ГХ-МС подтверждения  9-карбокси- THC в моче необходим в лаборатории для того, чтобы  подтверждать образцы, концентрация, которых по результатам предварительного метода анализа превышает немного пороговую концентрацию для  предварительного метода, т.е. 50 нг/мл. На практике, именно такие образцы и вызывают наибольшие трудности, особенно при подтверждении методом ТСХ (метод не столь чувствителен при очень низких концентрациях).

В качестве внутреннего стандарта был взят метаквалон.

Таблица 2.  Метаквалон, как внутренний стандарт. Преимущества и недостатки

Экспериментальная часть

Оборудование. Газовый хроматограф HP 5890 с масс-селективным детектором HP5971A. Капиллярная кварцевая колонка HP-5MS 12 м х 0,2 мм х 0,33 мкм. Скорость потока газа носителя – гелия 1 мл/мин. без деления потока. Температура колонки:   начальная температура  100ºС  (2 мин), нагрев до 275ºС  со скоростью  30ºС/мин. Температура инжектора  260ºС. Температура интерфейса  280ºС. Режим работы МСД – полное сканирование от 200 до 500 аем.

Пробоподготовка. Использовали  процедуру жидкость-жидкостной экстракции.

В экстракционную пробирку с притёртой пробкой из толстостенного стекла (чтобы использовать для центрифугирования) помещали  2 мл анализируемой мочи, добавляли внутренний стандарт – метаквалон (из расчёта 100 нг/мл), 200 мкл 1М NaOH. Пробирку тщательно закрывали притёртой пробкой и специальным запирающим устройством, выдерживали 20 мин в термоблоке при 60ºС и при естественных условиях остужали до комнатной температуры. Затем, к содержимому добавляли 500 мкл 2М HCl и 4 мл гексана. Содержимое  также тщательно закрывали и помещали в горизонтальный шейкер (300 колебаний/мин). Встряхивали в течение 5 мин в режиме 300 колебаний / минуту. Затем центрифугировали 30 мин в режиме 4000 об/мин.  Ограническую фазу переносили пастеровской пипеткой в 4 мл флаконы с завинчивающейся крышкой (не весь орг. слой @ 3.5 мл, чтобы избежать попадания в экстракт грязи ).  Испаряли органическую фазу досуха  для этого помещали флаконы в концентратор (TºС  нагревательного блока   40ºС) под ток азота (около 10-15 мин)).  К сухому остатку во флаконе  добавляли 50 мкл MSTFA, флакон тщательно закрывали завинчивающейся пробкой интенсивно встряхивали на мини шейкере и помещали его в термоблок на 30 мин  при 60ºС. После того, как содержимое остывало до комнатной температуры, его переносили в 2 мл  виалу с  конической вставкой.  Виалу закрывали металлическим колпачком и закатывали   кримпером.

С каждой серией исследуемых объектов – параллельно анализировали (выполняли всю процедуру экстракции, дериватизации и ГХ-МС анализа) контроль положительный (2 мл мочи отрицательной с добавкой 9-карбокси ТГК в концентрации 15 нг/мл)

Были реализованы различные условия щелочного гидролиза: варьировали условия и время проведения гидролиза мочи человека, курившего марихуану. После предварительного исследования методом ПФИА, результат можно было охарактеризовать как положительный, т.к. найденная концентрация превысила пороговую концентрацию для  предварительного метода, т.е. 50 нг/мл и составила 77 нг/мл,. Результаты количественного определения 9-карбокси-ТГК в моче (N=5) в зависимости от условий и  времени проведения гидролиза, приведены в табл. 3. В столбце V представлено среднее значение  концентрации (N=5)

Таблица 3.   Условия и время проведения гидролиза для последующей экстакции 9-карбокси-ТГК

Из выше представленных результатов можно сделать вывод, что предложенный к использованию метод экстракции 9-карбокси-ТГК из мочи (в таблице №3 - метод №3)   оптимален для подтверждения и количественного определения.

Представлены хроматограммы  объекта, направленного на подтверждение после предварительного скрининга  (С=103,4 нг/мл)

Рис. 2.  Фрагмент хроматограммы и масс-спектра реального образца № 3322 мочи человека, курившего марихуану

Рис. 3. Фрагмент хроматограммы и масс-спектра карбокси-ТГК 2ТМС реального образца № 3322 мочи человека, курившего марихуану с экстракцией по характеристическим ионам

В таблице 4 представлена форма протокола проведения анализа

Таблица 4. Протокол проведения анализа

Калибровочный график был построен на результатах анализа образцов мочи (2 мл), не содержащих каннабиноидов с добавками 9-карбокси-ТГК в различной концентрации (5, 10, 25, 50, 100, 250, 500 и 1000 нг/мл). В пределах  5-1000нг/мл наблюдалась линейность.

Предел обнаружения (LOD) 1-2 нг ТГК-СООН /мл

Предел определения (LOQ) 5 нг ТГК-СООН / мл

Статистические данные представлены в табл. № 5.

Среднее арифметическое (`Х), стандартное отклонение (S) и стандартное относительное отклонение (RSD %) были установлены после анализа образцов мочи (2 мл) с добавкой 9-карбокси-ТГК на уровне пороговой концентрации  - 15 нг/мл.

Таблица 5.  Статистические данные

• t = 2.776 (табл. величина при P = 95%) , n = 5
• S = 0.66;    Доверительный интервал      Δ`Х= t x S/√n
• Δ`Х =  ± 0,82         14.48  ± 0,82 (13,66 – 15,3)

Была создана стандартная форма рапорта. 

Для того, чтобы оценить метод было проанализировано около 70  образцов мочи. Корреляцию между полученными   и ожидаемыми результатами для контрольных образцов мочи и соответствие между результатами предварительного скрининга методом  ПФИА  и результатами  подтверждающего метода  можно увидеть в представленной таблице № 6.

Таблица 6. Случаи из практики

I. С < С cut-of (ПФИА)

**  RT Диклофенак-H₂O TMS (RI = 2170) ≈ RT Метаквалон (RI = 2155)

II. С cut-of (ПФИА) < С < 135 нг/мл

III. C > 135 ng/mL

В образце мочи №2483 случай  №12* был найден диклофенак, время удерживания которого совпадает с временем удерживания нашего аналита. В случае положительного результата на наличие каннабиноидов, полученного методом ПФИА, количественное определение было бы затруднено.

Выводы:

1. Разработан метод подтверждения 11-нор-∆9-тетрагидроканнабинол-9-карбокси кислоты в моче. Предложенный  метод   обеспечивает надёжное и точное подтверждение 11-нор-∆9-тетрагидроканнабинол-9-карбокси кислоты и может быть использован, как количественный метод.
2. Предложенный метод пробоподготовки для подтверждения 11-нор-∆9-тетрагидроканнабинол-9-карбокси кислоты хорошо воспроизводим, быстр в исполнении, что особенно важно в рутинном химико-токсикологическом анализе.
3. Установлены оптимальные условия проведения щелочного гидролиза для малых проб мочи.
4. Показаны преимущества использования флюоресцентно-поляризационного иммуноанализатора AxSYM (Abbot) в рутинном химико-токсикологическом анализе.