Обнаружение и определение лекарственных веществ нейтрального и основного характера в крови (сыворотке) газохроматографическим методом с использованием азотно-фосфорного детектора

/ Крупина Н.А. Краснова Р.Р. Ковалева Т.А.  // Мат. VI Всеросс. съезда судебных медиков. — М.-Тюмень, 2005.

Крупина Н.А., Краснова Р.Р., Ковалева Т.А. Обнаружение и определение лекарственных веществ нейтрального и основного характера в крови (сыворотке) газохроматографическим методом с использованием азотно-фосфорного детектора

(Московская область)

ссылка на эту страницу

Предложен газохроматографический метод с использованием азотно-фосфорного детектора для качественного и количественного анализа лекарственных веществ нейтрального и основного характера в крови (сыворотке). Предложен способ экстракции  лекарственных  веществ  из 1 мл крови.

1.Введение.

В настоящее время уже нет необходимости говорить о возможностях и роли газовой хроматографии в современном анализе. Она прочно заняла ведущее место среди наиболее эффективных методов анализа и широко применяется в судебно-химических и химико-токсикологических лабораториях [1,3]. Газовая хроматография с использованием азотно-фосфорного детектора является высоко чувствительным, селективным методом, позволяющим обнаруживать и определять лекарственные вещества на уровне терапевтических концентраций в биопробах человека [7,8].

При проведении судебно-химических экспертиз большое значение имеет количественное определение лекарственного вещества в биообъектах. Количественное определение позволяет дифференцировать терапевтическую, токсическую и летальную концентрации или установить влияние лекарственных, в том числе психотропных веществ, на поведение человека. Наилучшим объектом для исследования является кровь.

Изучив работы [4,7,8], посвященные газохроматографическому анализу лекарственных веществ, мы остановились на газохроматографическом методе определения лекарственных веществ в крови и сыворотке с использованием азотно-фосфорного детектора.

Целью нашей работы была разработка метода идентификации и количественного определения широкого спектра лекарственных веществ в крови и сыворотке, который мы могли бы использовать в рутинном анализе.

2.Экспериментальная часть.

2.1. Объект исследования.

Объектами являются цельная кровь или сыворотка. В качестве контроля использовали бланковую плазму – плазму, не содержащую лекарственных веществ (плазму получали из отделения переливания крови в МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского и анализировали на наличие лекарственных веществ).

2.2. Стандарты и реактивы.

Трис-гидроксиметил-аминометан (трис-буфер) С4 Н 11 NO3 1М, бутилацетат, дифениламин в метаноле (ДФА - внутренний стандарт)  20 мкг/мл, стандартные растворы лекарственных веществ в концентрации 1мг/мл в метаноле.

2.3. Оборудование.

Газовый хроматограф Agilent Technologies 6890N с азотно-фосфорным детектором, смешиватель вибрационный “IKA VIBRAX”, центрифуга “Jouan”.

2.4. Условия газохроматографического анализа.

Колонка хроматографа капиллярная HP-5 (5% фенилметилсилоксан) (30м х 0.32мм x 0.25 мкр м). Начальная температура колонки 600С. Время выдержки при начальной температуре –0.70 мин. Подъем температуры в диапазоне 60-1400С –200/мин, 140-2900С –100/мин. Время выдержки при конечной температуре 9,5мин. Температура инжектора 2700С. Режим без деления потока. Температура детектора 3000С. Начальный поток 7.4мл/мин. Средняя скорость 84см/сек. Объем вводимой пробы 1мкл.

2.5. Пробоподготовка.

В  стеклянную  пробирку  на  10 мл вносили  1 мл  крови,  добавили 50 мкл ДФА, 300 мкл трис-буфера и интенсивно встряхнули на вибро-встряхивателе. Образец экстрагировали 300 мкл бутилацетата (2 минуты) и центрифугировали  в течение 5 минут при 4000об/мин. 150 мкл органической фазы переносили в виалу с конической вставкой и 1 мкл извлечения вводили в испаритель хроматографа.

2.6. Качественный анализ.

Идентификацию пиков, полученных при анализе пробы, производили по времени удерживания. Параллельно с исследуемым образцом анализировали контроли – положительный (извлечение из плазмы, содержащей исследуемое лекарственное вещество) и отрицательный (извлечение из бланковой плазмы) [4].

2.6. Количественный анализ.

Количественный анализ проводили с использованием метода внутреннего стандарта.

В качестве внутреннего стандарта нами был выбран дифениламин (ДФА) т.к. он не встречается в объектах, направляемых на исследование, имеет хорошие хроматографические свойства и экстрагируется в условиях данного метода.

Для построения калибровочного графика использовали бланковую плазму с добавлением стандартных растворов лекарственных веществ на уровне терапевтических, токсических и летальных концентраций [5,6].

Для расчёта концентрации лекарственных веществ в исследуемых образцах использовали программное обеспечение ChemStation, позволяющее строить калибровочные графики по данным калибровочных таблиц.

3. Результаты

Нами были проанализированы 20 веществ. Ниже приведены времена удерживания некоторых из них:

  1. Амитриптилин                  12.68
  2. Диазепам                            14.75
  3. Дифениламин                    7.22
  4. Димедрол                           9.73
  5. Клозапин                           17.87
  6. Нортриптилин                   12.82
  7. Но-шпа                               17.90
  8. Тизерцин                            15.40

На рис. 1 представлена хроматограмма тестовой смеси, в состав которой входят ДФА, димедрол, амитриптилин, нортриптилин в концентрации 2нг/мкл каждого.

Рис. 1. Хроматограмма тестовой смеси.

Пределы обнаружения, определения, линейность для некоторых из исследованных нами веществ представлены в табл. 1.

Таблица 1

Предел определения, предел обнаружения, линейность.

Вещество

Предел обнаружения  (мг/л)

Предел определения (мг/л)

Линейность (мг/л)

Дифениламин

0.0100

0.0300

___

Амитриптилин

0.0020

0.0050

0.050-10.000

Диазепам

0.0100

0.0500

0.100-10.000

Димедрол

0.0030

0.0100

0.200-10.000

Клозапин

0.0225

0.0675

0.225-22.500

Нортриптилин

0.0200

0.1000

0.100-10.000

Но-шпа

0.2000

1.0000

1.000-5.000

Тизерцин

0.0050

0.0100

0.050-0.100

 

На рис. 2 показан калибровочный график для димедрола.

Рис. 2. Калибровочный график.

 

Статистическая обработка результатов [2].

Статистическая обработка результатов для исследованных нами лекарственных веществ приведена в табл. 2.

Таблица 2.

Результат измерения (хi), среднее значение (`Х), стандартное отклонение (S), относительное стандартное отклонение (RSD[%]), доверительный интервал (`Х±Δ`Х) при заданной вероятности (Р).

Вещество

хi

Метрологические характеристики

Амитриптилин

С=0.50мг/л

0.50

0.48

0.46

`Х=0.48
S=0.02
RSD(%)=4.2
Р=0,90
(`Х± Δ`Х)=0.45÷0.51

Амитриптилин

С=1.00мг/л

1.00

0.97

1.04

`Х=1.00
S=0.04
RSD(%)=3.5
Р=0,90
(`Х±Δ`Х)=0.93÷1.07

Амитриптилин

С=2.00мг/л

2.00

2.04

1.96

`Х=2.00
S=0.04
RSD(%)=2.0
Р=0,90
(`Х±Δ`Х)=1.93÷2.07

Амитриптилин

С=5.00мг/л

5.00

4.32

4.47

`Х=4.60
S=0.69
RSD(%)=15.1
Р=0,90
(`Х±Δ`Х)=3.44÷5.76

Амитриптилин

С=10.00мг/л

10.00

10.07

8.89

`Х=9.65
S=0.66
RSD(%)=6.8
Р=0,90
(`Х±Δ`Х)=8.54÷10.76

Диазепам

С=0.100мг/л

0.100

0.097

0.092

`Х=0.096
S=0.004
RSD(%)=4.2
Р=0,90
(`Х±Δ`Х)=0.089÷0.103

Диазепам

С=0.50мг/л

0.50

0.45

0.48

`Х=0.48
S=0.03
RSD(%)=6.3
Р=0,90
(`Х±Δ`Х)=0.43÷0.53

Диазепам

С=1.00мг/л

1.00

0.85

0.82

`Х=0.89
S=0.10
RSD(%)=11.2
Р=0,90
(`Х±Δ`Х)=0.72÷1.06

Диазепам

С=5.00мг/л

5.00

4.93

5.09

`Х=5.01
S=0.08
RSD(%)=1.6
Р=0,90
(`Х±Δ`Х)=4.88÷5.14

Диазепам

С=10.00мг/л

10.00

10.12

9.65

`Х=9.92
S=0.24
RSD(%)=2.5
Р=0,90
(`Х±Δ`Х)=9.52÷10.32

Димедрол

С=0.200мг/л

0.200

0.203

0.198

`Х=0.200
S=0.003
RSD(%)=1.5
Р=0,90
(`Х±Δ`Х)=0.195÷0.205

Димедрол

С=1.00мг/л

1.00

0.93

1.20

`Х=1.04
S=0.14
RSD(%)=13.5
Р=0,90
(`Х±Δ`Х)=0.80÷1.28

Димедрол

С=5.00мг/л

5.00

5.89

4.67

`Х=5.19
S=0.63
RSD(%)=12.1
Р=0,90
(`Х±Δ`Х)=4.13÷6.25

Димедрол

С=10.00мг/л

10.00

10.08

8.96

`Х=9.68
S=0.62
RSD(%)=6.5
Р=0,90
(`Х±Δ`Х)=8.63÷10.73

Клозапин

С=1.35мг/л

1.35

1.18

1.39

`Х=1.34
S=0.16
RSD(%)=11.9
Р=0,90
(`Х±Δ`Х)=1.07÷1.61

Клозапин

С=1.80мг/л

1.80

2.06

1.97

`Х=1.94
S=0.13
RSD(%)=6.8
Р=0,90
(`Х±Δ`Х)=1.72÷2.16

Клозапин

С=4.50мг/л

4.50

4.24

4.24

`Х=4.33
S=0.15
RSD(%)=3.5
Р=0,90
(`Х±Δ`Х)=4.08÷4.58

Клозапин

С=6.75мг/л

6.75

7.22

7.90

`Х=7.29
S=0.58
RSD(%)=7.9
Р=0,90
(`Х±Δ`Х)=6.31÷8.27

Нортриптилин

С=0.100мг/л

0.100

0.092

`Х=0.096
S=0.004
RSD(%)=4.2
Р=0,75
(`Х±Δ`Х)=0.089÷0.103

Нортриптилин

С=0.200мг/л

0.200

0.213

0.171

`Х=0.195
S=0.022
RSD(%)=11.0
Р=0,90
(`Х±Δ`Х)=0.158÷0.232

Нортриптилин

С=0.50мг/л

0.50

0.55

0.56

`Х=0.54
S=0.03
RSD(%)=6.0
Р=0,90
(`Х±Δ`Х)=0.49÷0.59

Нортриптилин

С=1.00мг/л

1.00

1.04

1.06

`Х=1.03
S=0.03
RSD(%)=3.0
Р=0,90
(`Х±Δ`Х)=0.98÷1.08

Нортриптилин

С=10.00мг/л

10.00

10.32

9.97

`Х=10.01
S=0.22
RSD(%)=2.2
Р=0,90
(`Х±Δ`Х)=9.64÷10.38

Но-шпа

С=1.00мг/л

1.00

0.89

0.92

`Х=0.94
S=0.06
RSD(%)=6.1
Р=0,90
(`Х±Δ`Х)=0.84÷1.04

Но-шпа

С=5.00мг/л

5.00

5.20

4.87

5.00

4.87

`Х=4.99
S=0.14
RSD(%)=2.7
Р=0,95
(`Х±Δ`Х)=4.82÷5.16

Тизерцин

С=0.050мг/л

0.050

0.053

0.049

`Х=0.051
S=0.002
RSD(%)=4.2
Р=0,90
(`Х±Δ`Х)=0.048÷0.054

Тизерцин

С=0.100мг/л

0.100

0.102

0.095

`Х=0.099
S=0.004
RSD(%)=4.0
Р=0,90
(`Х±Δ`Х)=0.092÷0.106

 

4. Обсуждение результатов.

Предложен метод для скрининга и количественного определения разных групп лекарственных веществ нейтрального и основного характера. Метод обладает высокой чувствительностью и позволяет определять терапевтические концентрации веществ в 1 мл крови.

Применяемые в настоящий момент методы пробоподготовки биопроб требуют большую размерность пробы, а значит, и большого количества высокотоксичных растворителей, работа с которыми вредит здоровью сотрудников и загрязняет окружающую среду. В предлагаемом методе используется всего лишь 1 мл пробы и расходуется 300 мкл растворителя. Процедура пробоподготовки занимает мало времени, что особенно важно при экспресс-диагностике острых отравлений.

Метод надежен, селективен, обладает высокой воспроизводимостью. Соблюдается линейность при построении калибровочных графиков для всех исследованных веществ от терапевтического значения, до летального. Специфичность метода заключается в том, чтобы безошибочно отдифференцировать анализируемое вещество от других компонентов, в том числе от эндогенных компонентов. Чтобы удостоверится в отсутствии влияния биологической матрицы, (крови) были проанализированы отрицательные бланковые пробы.

Было установлено, что времена удерживания исследуемых веществ хорошо воспроизводятся в условиях метода.

Метод количественного определения лекарственных веществ в крови применен при исследовании экспертного материала. Нами был проведен качественный анализ и количественное определение лекарственных веществ в 50 экспертных случаях. В табл.3 представлено несколько из них.

 

Таблица 3

Случаи из практики.

Обстоятельства дела

Обнаруженное
вещество

Концент-рация в крови, мг/л

1

Женщина, 44 лет, с целью суицида приняла азалептин. Умерла через 5 дней в больнице.

Клозапин 5.57

2

Женщина, 17 лет, обнаружена мертвой в квартире. Наркоманка.

Димедрол

3.72

3

Женщина обнаружена дома мертвой.

Амитриптилин

Нортриптилин

3.05

2.19

4

Женщина, обнаружена мертвой, отравление амитриптилином.

Амитриптилин Димедрол

Тизерцин

13.06

0.05

0.03

5

Мужчина, 29 лет, отравление таблетками.

Амитриптилин

Диазепам

2.51

0.36

 

5. Выводы

  1. 1.Предложен газохроматографический метод с использованием азотно-фосфорного детектора для качественного и количественного определения в крови (сыворотке) лекарственных веществ нейтрального и основного характера.
  2. Метод высоко чувствителен, специфичен, хорошо воспроизводим и не требует большой размерности пробы.
  3. Схема пробоподготовки биообъекта рациональна, воспроизводима, не требует больших объёмов растворителя при экстракции и проста в исполнении, что очень важно в рутинном судебно-химическом анализе. В процедуре пробоподготовки сведены до минимума потери при экстракции.
  4. Метод позволяет определить терапевтические концентрации лекарственных веществ в 1 мл крови также хорошо, как и концентрации в случаях с летальным исходом.
  5. Нами планируется проводить дальнейшую исследовательскую работу для создания базы данных для других лекарственных веществ, встречающихся в экспертной практике.

похожие материалы в каталогах

Судебно-химические исследования

похожие статьи

Состояние и перспективы исследования цитомединов печени / Авдохиев Г.И., Кузьмина О.В., Кот М.Л. // Матер. IV Всеросс. съезда судебных медиков: тезисы докладов. — Владимир, 1996. — №2. — С. 43-44.

К вопросу об анализе фосфорорганических пестицидов методом ТСХ / Горбачева Н.А. // Матер. IV Всеросс. съезда судебных медиков: тезисы докладов. — Владимир, 1996. — №2. — С. 145-146.

Проблемные аспекты химикотоксикологического исследования психоактивных веществ / Клименко Т.В., Клевно В.А., Максимов А.В. // Судебная медицина. — 2018. — №4. — С. 36-40.

Установление наличия кала в следах на вещественных доказательствах методом восходящей тонкослойной хроматографии / Четвертнова А.П., Федоровцев А.Л., Эделев Н.С. // Судебная медицина. — 2018. — №4. — С. 30-32.

Влияние давности и температуры хранения трупной крови на показатели веществ низкой и средней молекулярной массы (ВНСММ) / Эделев И.С. // Вестник судебной медицины. — Новосибирск, 2018. — №3. — С. 15-18.