Определение препарата УП-583 в биологическом материале

Препарат УП-583 применяется в качестве отвердителя различных марок эпоксидных клеев. Вследствие своей токсичности и широкого применения наблюдаются случаи смертельных отравлений этим веществом. Методы анализа его как в чистом виде, так и в биологическом материале не разработаны. Целью нашей работы явилась разработка методов изолирования, обнаружения и количественного определения препарата УП-583 в биологическом материале.

Экспериментальная часть. По химическому строению препарат УП-583 представляет собой O={N, N, -бис[2-амино-этил (аминометил)]фенол}. С учетом структуры этого вещества были разработаны методы его анализа.

В фарфоровых чашках испаряли при комнатной температуре по 1 капле 0,01 % спиртового раствора препарата УП-583. С остатками его проводили следующие реакции путем добавления:

• 1)    2 капель 2 % спиртового раствора ванилина и концентрированной серной кислоты (наблюдали оранжевое окрашивание);
• 2)    1 капли 1% раствора парадиметиламинобензальдегида в концентрированной серной кислоте (коричневое окрашивание);
• 3)    2 капель воды, 2 % раствора аминоатипирина, 25 % раствора аммиака и 2 % раствора ферроцианида калия (бурое окрашивание);
• 4)    2 капель 1% ванадата натрия в концентрированной серной кислоте (фиолетовое окрашивание):
• 5)    5 капель формальдегида серной кислоты — реактива Марки (красно-фиолетовое окрашивание);
• 6)    на фильтровальную бумагу по капле 0, 01 % спиртового раствора препарата УП-583. 10% раствора едкого натра и смеси 5 мг 1% раствора сульфаниловой кислоты с 0,5 мг 10% раствора нитрита натрия (оранжевое окрашивание);
• 7)    на предметное стекло капли 0, 01 % спиртового раствора препарата УП-583. а после испарения растворителя капли бромной воды (под микроскопом наблюдали игольчатые кристаллы и их сростки в виде розеток);
• 8)    на пластинки «Силуфол» по капле 0,01 % раствора препарата УП-583 в хлороформе, и хроматографировали в системах: а) метанол — 25% раствор аммиака (100: 1,5); б) хлороформ — ацетон (9:1); в) пропиловый спирт, г) толуол Пластинки проявляли формальдегидсерной кислотой (фиолетовые пятна) опрыскиванием растворами 25 % аммиака, 2% аминоантипирина и 2% ферроцианида калия (бурые пятна), модифицированным по Мунье реактивом Драгендорфа [1] и насыщенным раствором тиосульфита натрия (оранжевые пятна). В УФ-лучах препарат УП-583 на пластинках флюоресцирует голубым цветом. Величины R_f в указанных системах соответственно равны 0,3, 0,4, 0,6 и 0,5.

На спектрофотометре СФ-16 в кювете 1 см снимали УФ-спектры препарата УП-583 в хлороформе и этаноле. В обоих растворителях максимум поглощения наблюдали при 272-273 нм.

Чувствительность изученных методов обнаружения препарата УП-583 представлена в табл. 1.

Из табл. 1 видно, что все предложенные методы обнаружения препарата УП-583 являются в достаточной степени чувствительными (микрокристаллическая реакция с бромной водой менее чувствительна). Хлорофос, дихлофос, карбофос, фосфамид, производные барбитуровой кислоты предложенными методами не обнаруживались.

Таблица 1

Чувствительность методов обнаружения препарата УП-583

Морфин, кодеин, жидкости ДБ и ОП-7 давали окрашивание с формальдегидсерной кислотой. Производные 1,4-бензодиазепина давали окрашивание с реактивом Драгендорфа на пластинках «Силуфол». но имели другое значение R_f и не давали реакций с формальдегидсерной кислотой и аминоантипирином.

Количественное определение. Использовали фотоэлектроколориметрический метод на основе реакции с формальдегидсерной кислотой. Для построения калибровочного графика в пробирки вносили от 0, 1 до 1 мл 0, 001% раствора препарата УП-583 в пропиловом спирте, что соответствовало 0, 1—1, 0 мг чистого вещества. Добавляли пропиловый спирт до объема 2 мл, по 1 капле 40 % раствора формальдегида и по 3 мл концентрированной серной кислоты. Смеси перемешивали и измеряли оптическую плотность на фотоэлектроколориметре ФЭК-3 ал в кювете 1 см со светофильтром 550 нм. Раствором сравнения являлась вода. Аналогичным способом получали окрашенные пробы исследуемых растворов препарата УП-583 с последующим определением их оптических плотностей. Окраска оказалась устойчивой в течение нескольких часов. Подчнияемость закону Бера от 0, 1 до 2 мг. чувствительность 20 мкг/мл.

Исследование биологического материала. Препарат УП-583 растворим в воде, хлороформе и спирте. Для его изолирования из биологического материала использовали общепринятые методы Стаса — Отто и А. А. Васильевой [2]. К 100 г измельченной печени добавляли от 20 до 50 мг препарата УП-583. Через 24 ч исследовали каждым из этих методов. На конечных этапах извлечение хлороформом проводили из двух сред вначале при pH 2, 0, затем при pH 10, 0. Хлороформные извлечения доводили до точного объема, исследовали их при помощи качественных реакций и затем проводили количественное определение. Положительные результаты по обнаружению препарата УП-583 в извлечениях были получены при использовании цветных реакций и тонкослойной хроматографии. Большие количества препарата УП-583 определяли в кислых извлечениях (табл. 2). в то же время в щелочных извлечениях содержание его не превышало по методу Стаса — Отто 2,5%. по методу А. А. Васильевой — 1,5%.

Данные табл. 2 свидетельствуют о хорошей воспроизводимости метода и о том, что максимальный выход препарата УП-583 при исследовании печени обеспечивает метод А. А. Васильевой.

В контрольных опытах с печенью при проведении качественных реакций без добавления исследуемого вещества получены отрицательные результаты. Биологический фон при количественном определении не превышал 0, 03.

Определение препарата УП-583 в кислых извлечениях из печени

Таблица 2

На основе экспериментальных данных была рекомендована следующая методика. 100 г измельченного объекта (желудок, тонкая кишка, печень, почка) смешивают с 200 мл воды, подкисляют 12 % соляной кислотой до pH 2,0 (по универсальной индикаторной бумаге) и периодически помешивают в течение 2 ч. Смесь центрифугируют в течение 20 мин при 3000 об/мин. Центрифугат отделяют, объект смешивают с 50 мл воды и вновь центрифугируют, затем объединяют и извлекают 3 раза по 33 мл хлороформом при pH 2,0. Хлороформные извлечения объединяют и доводят хлороформ до объема 100 мл в мерной колбе. 50 мл извлечения испаряют при комнатной температуре до объема 1 мл. В 2 точки на стартовой линии пластинки Силуфол» наносят по капле сконцентрированного извлечения. В 3-ю точку вводят метчик-каплю 0,01 % раствора препарата УП-583 в хлороформе. Сконцентрированное извлечение наносят также в виде полосы 4X0,5 см. Пластинку хроматографируют в системе пропиловый спирт, рассматривают в УФ-лучах, отмечая флюоресцирующие зоны, и затем по частям проявляют реактивами. Так зону метчика и зону одной исследуемой точки проявляют модифицированным реактивом Драгендорфа и насыщенным раствором тиосульфата натрия. Зону другой исследуемой точки опрыскивают 25 % раствором аммиака и 2 % растворами аминоантипирина и ферроцианида калия. Место локализации препарата УП-583 в зоне нанесения извлечения в виде полосы вырезают ножницами, извлекают 5 мл хлороформа в течение 10 мин. фильтруют и снимают УФ-спектр фильтрата на спектрофотометре типа СФ-16. О наличии препарата УП-583 свидетельствует совокупность признаков: флюоресцирующее голубым цветом пятно с величиной R_f 0,6, окрашенные пятна с таким же значением R_f с аминоантипирином и реактивом Драгендорфа и максимумом поглощения при 272—273 нм.

Для определения количества препарата УП-583 используют оставшееся извлечение, аликвотные части которого (10 и 40 мл) испаряют в фарфоровых чашках при комнатной температуре. Остатки растворяют в 2 мл пропилового спирта и исследуют, как было указано ранее. Концентрацию рассчитывали по той пробе, оптическая плотность которой находится в пределах калибровочного графика.

Для определения препарата УП-583 в крови и моче трупов к 10 мл этих объектов добавляют 50 мл метанола. Смеси перемешивают и через 15 мин фильтруют. Фильтраты испаряют на водяной бане при 50°С. Остатки растворяют в 10 мл хлороформа и исследуют по приведенной методике.

Границы обнаружения и определения препарата УП-583 в печени трупа соответственно равны 0,5 и 1 мг%.

Выводы

1. Разработаны методы обнаружения и количественного определения препарата УП-583 в чистом виде.
2. Препарат УП-583 можно изолировать общепринятыми методами Стаса — Отто и А. А. Васильевой из кислой и щелочной среды, причем максимальные количества извлекаются из кислой среды.
3. Разработан метод изолирования, обнаружения и определения препарата УП-583 в биологическом материале. Из печени извлекают 73—82% препарата. Границы обнаружения и определения его соответственно равны 0, 5 и 1 мг%.

ЛИТЕРАТУРА

1. Крамаренко В.Ф. Химико-токсикологический анализ. — Киев, 1982. — С. 259.
2. Швайкова М. Д. Токсикологическая химия. — 3-е изд. М., 1975. — С. 120-124.