О генетически обусловленном полиморфизме диафоразы спермы

/ Гладких А.С.  // Судебно-медицинская экспертиза. — М., 1978 — №1. — С. 28-31.

Гладких А.С. О генетически обусловленном полиморфизме диафоразы спермы

(Москва)

УДК 612.616.2.015.2.052

О генетически обусловленном полиморфизме диафоразы спермы. Гладких А.С. Суд.-мед. эксперт., 1978, № 1, с. 28-31

Показана возможность выявления генетически обусловленных диафоразных групп спермы (Dia-1, Dia-2-l и Dia-2) не только в цельной сперме и лизатам сперматозоидов, но и в семенных пятнах.

Иллюстраций 2.

 

STUDIES ON GENETICALLY DETERMINED SEMINAL DIAPHORASE POLUMORPHISMS

A. S. Gladkikh

Liquid semem samples of 86 persons, experimental seminal stains on cotton fabric, and testes homogenates from 24 dead bodies were studied by starch gei electrophoresis and polyacrylamide gel disc-electrophoresis. Genetically determined groups of seminal diaphorase (Dia-1, Dia-2-1, and Dia-2) were demonstrated both in liquid semen (whole semen and spermatozoa lysates), and in seminal stains.

ссылка на эту страницу

Система АВО(Н), полиморфизм которой проявляется в сперме выделителей, часто бывает недостаточной для групповой дифференцировки семенных пятен. Открытие в сперме группового полиморфизма фосфоглюкомутазы и 6-фосфоглюконатдегидрогеназы, совпадающего с эритроцитарным полиморфизмом этих ферментов, значительно расширило экспертные возможности в этом направлении. Исследования Renninger и Sina (1970), Radam и Strauch (1971), А.С. Гладких (1976) показали возможность выявления групп этих ферментов в свежих пятнах спермы и влагалищных выделений. В то же время очевидна и актуальность для судебной медицины поиска новых генетически обусловленных маркеров спермы, выявляемых в ее следах.

С этой точки зрения весьма интересны исследования Caldwell и соавт. (1976), которые путем электрофоретического анализа спермы с последующим выявлением диафоразной активности открыли три диафоразных фенотипа спермы Dia-1, Dia-2 и Dia-2-l, контролируемых двумя кодоминантными аллелями SD1 и SD2 (sperm diaphorase) в одном аутосомальном локусе. Согласно этой гипотезе, диафоразные фенотипы спермы Dia-1 и Dia-2 являются гомозиготными по соответствующему аллелю SD1 и SD2, а фенотип Dia-2-l — гетерозиготным. Исследовали 52 образца спермы и выявили фенотип Dia-1 в 29, Dia-2-l —в 16 и Dia-2 в 7 образцах, что, согласно закону Харди — Вейн-берга, определило частоту распределения аллелей SD1 и SD2 — соответственно 0,71 и 0,29. Впервые о полиморфизме эритроцитарной диафоразы сообщили Hopkinson и соавт. (1970). Они, а также Detter и соавт. (1970), Tariverdian и соавт. (1970), Potrafki и соавт. (1972) показали, что различные варианты фермента контролируются обычным аллелем Dia1 и пятью другими редкими аллелями Dia2-6 в одном аутосомальном локусе. Из-за крайней редкости вариантов эритроцитарной диафоразы этот фермент не изучался судебными медиками.

Диафоразные группы спермы, открытые в 1976 г., также до сих пор никем не изучены в судебно-медицинском отношении.

Мы поставили цель разработать методику выявления диафоразных групп в жидкой цельной сперме и спермолизатах, в гомогенатах яичек, а также в пятнах спермы с учетом возможности использования этого ферментного полиморфизма спермы в судебно-медицинской практике.

Материал и метод. Исследовали сперму 86 мужчин и гомогенаты яичек 24 трупов. Спермолизаты готовили путем многократного замораживания и оттаивания отмытых сперматозоидов с последующим их центрифугированием. Кусочки яичек промывали в дистиллированной воде, гомогенизировали в микрогомогенизаторе с равным объемом физиологического раствора, центрифугировали и исследовали прозрачную надосадочную жидкость. Пятна спермы готовили на хлопчатобумажной ткани и хранили при комнатной температуре. Исследуемый материал разделяли электрофорезом в гелях крахмала и полиакриламида. Электрофорез в крахмальном геле проводили по методике Brewer и соавт. (1967). Основной буфер: 0,9 М трис, 0,5 М Н3В03, 0,2 М ЭДТА (динатриевая соль). Переходный буфер: основной в разведении 1:7. Гелевый буфер: основной в разведении 1 : 10, pH 8,6. Электрофорез проводили 17 ч при 4°С с градиентом напряжения 5 В/см. При использовании полиакриламидного геля применяли метод вертикального диск-электрофореза в плексигласовых трубках. При этом концентрация разделяющего геля составила 7%, а концентрирующего — 3%. Использовали трис-глици-новую буферную систему, pH 8,3, электрофорез проводили 3 ч при силе тока на одну трубку 6 мА. Диафоразную активность выявляли по методу Kaplan и Beutler (1967). В состав инкубационной смеси входил НАД-Н, тетразолиевый МТТ и дихлорфенолин-дофенол.

Результаты исследования. Во всех 86 образцах цельной спермы и соответственно в лизатах отмытых сперматозоидов посредством дискового электрофореза в полиакриламидном геле четко выявлялись диафоразные группы спермы. Dia-1 характеризовалась наличием двух изоферментов (а и с), Dia-2 — также двух изоферментов (Ь и d), а группа Dia-2-l — наличием всех четырех изоферментов (а, Ь, с и d). Эквивалентная смесь спермы Dia-1 и Dia-2 давала электрофоретическую картину гетерозиготной диафоразной группы Dia-2-1, что свидетельствует о двуаллельности системы диафоразы спермы. В наших исследованиях диафоразная группа Dia-1 была определена в 52, Dia-2-1 — в 23 и Dia-2 — в 11 образцах, что определило частоту распределения аллелей SD1 и SD2 соответственно 0,73 и 0,27. Несмотря на небольшое число образцов спермы, исследованных Caldwell и соавт. и нами (52 и 86 соответственно), почти полное совпадение в распределении аллелей, контролирующих диафоразные группы спермы, свидетельствует о благоприятной частоте встречаемости всех трех ее диафоразных групп.


Рис. 1. Групповые диафоразные изоферменты
спермы в геле полиакриламида.
a — пятно спермы 3-недельной
давности; b, c и d — жидкая цельная сперма
трех диафоразных групп.

С целью изучения возможности установления диафоразных групп спермы в трупном материале исследовали гомогенаты яичек 24 трупов.

Хотя некоторый полиморфизм в распределении диафоразных изоферментов в гомогенатах яичек разных трупов и наблюдался, однако он не совпадал с групповым изоферментным спектром сперматозоидов и цельной спермы. Это, по-видимому, можно объяснить присутствием в гомогенатах яичек изоферментов тканевой диафоразы, которые затушевывают групповой изоферментный спектр диафоразы сперматозоидов и препятствуют установлению диафоразных групп спермы.

В большинстве образцов спермы наблюдали высокую диафоразную активность, и лишь в некоторых образцах она была низкой. Это влияло и на возможность выявления диафоразных групп в экспериментальных пятнах спермы. Во всех случаях, когда диафоразная активность цельной спермы была высокой (75 образцов), ее диафоразные группы можно было диагностировать и в пятнах спермы в течение 3—4 нед (рис. 1). В 11 образцах с низкой активностью фермента диафоразные группы могли быть установлены только в пятнах, давность которых не превышала 7—10 дней. Обязательным условием при исследовании пятен спермы с низкой диафоразной активностью являлось добавление в полиакриламидный гель до его полимеризации ко-фермента — НАД-Н в количестве 10 мг на 30 мл геля.

Этим повышалась чувствительность реакции выявления изоферментов в геле полиакриламида, что облегчало диагностику диафоразных групп в пятнах спермы. Однако избыток НАД-Н, внесенного в составные компоненты полиакриламидного геля (например, 25—30 мг на 30 мл геля), затруднял его полимеризацию и несколько искажал электрофоретическую подвижность изоферментов диафоразы, затрудняя ее групповую диагностику.

Для диагностики диафоразных групп спермы мы апробировали и более доступный метод горизонтального электрофореза в крахмальном геле, который многие зарубежные авторы используют для изучения диафоразного полиморфизма эритроцитов человека. Использовали трис-ЭДТА-Н3В03 буферную систему с pH 8,6 по Brewer и соавт. (1967), однако катодный электродный буфер имел вдвое меньшую концентрацию ионов по сравнению с анодным. Для выявления диафоразной активности применили метод агаровой аппликации, причем лучшие результаты были получены при обработке геля агаровым раствором, содержащим 20 мг НАД-Н, 5 мг дихлорфенолиндофенола, 20 мг тетразолиевого МТТ в смеси 25 мл трис-НС1-буфера (0,025 М, pH 8,5) и 25 мл 2% водного агара. Диафоразные зоны спермы выявлялись при 37°С спустя 1 — 2 ч после застывания агара.

Рис. 2. Диафоразные группы спермы в геле крахмала.
Вверху — цельная сперма группы Dia-1; в центре и внизу пятна спермы диафоразных групп Dia-2 и Dia-l соответственно.

Разделение диафоразных изоферментов спермы в геле крахмала было несколько хуже по сравнению с полиакриламидным гелем, однако все же достаточно для дифференцирования диафоразных групп (рис. 2). При исследовании пятен спермы непосредственно перед варкой крахмального геля в гелевый буфер добавляли кофермент НАД-Н — 60 мг на 180 мл геля. До начала электрофореза в электродный буфер катода также добавляли кофермент НАД-Н из расчета 100 мг на 500 мл буфера. Такое добавление, как и в случае с полиакриламидным гелем, повышало чувствительность реакции по выявлению ферментативной активности диафоразы спермы и делало возможной диагностику ее групп в семенных пятнах.

Выводы

  1. Показана возможность выявления генетически детерминированных диафоразных групп в цельной сперме, лизатах сперматозоидов и в семенных пятнах.
  2. На 86 образцах спермы определена частота встречаемости аллелей SD1 и SD2, контролирующих появление трех диафоразных групп Dia-1, Dia-2-1 и Dia-2, которая составила соответственно 0,73 и 0,27.
  3. Для выявления групповых изоферментов диафоразы спермы пригодны методы электрофореза в крахмальном геле и диск-электрофореза в геле полиакриламида.
  4. Выявление диафоразных групп в семеных пятнах значительно расширит современные возможности их группового дифференцирования на вещественных доказательствах.

похожие материалы в каталогах

Обнаружение и исследование спермы

похожие статьи

Выявление спермина в пятнах спермы путем электрофореза на бумаге / Буреш Л. // Судебно-медицинская экспертиза. — М., 1968. — №3. — С. 46-47.

О применении сока из клубней картофеля для обнаружения спермы на вещественных доказательствах / Тюрникова Ф.В. // Судебно-медицинская экспертиза. — М., 1968. — №2. — С. 27-28.

О реакции на сперму с соком из клубней картофеля / Инглез О.В. // Судебно-медицинская экспертиза. — М., 1968. — №1. — С. 49-51.

К вопросу о реакции человеческой спермы с картофельным соком / Барсегянц Л.О. // Судебно-медицинская экспертиза. — М., 1967. — №3. — С. 35-39.

Установление наличия и видовой принадлежности человеческой спермы при помощи некоторых растительных экстрактов / Барсегянц Л.О. // Судебно-медицинская экспертиза. — М., 1967. — №1. — С. 34-36.