Сравнительная оценка методов изолирования аминазина из трупного материала

/ Саломатин Е.М.  // Судебно-медицинская экспертиза. — М., 1967 — №2. — С. 27-33.

Саломатин Е.М. Сравнительная оценка методов изолирования аминазина из трупного материала

УДК 340.67: 615.786 (Aminazinum)

Научно-исследовательский институт судебной медицины (дир. — проф.В. И. Прозоровский) Министерства здравоохранения СССР, Москва

Salomatin E. M.: Confronting Various Methods of Aminazine Isolation from Cadaveric Matter

Поступила в редакцию 10/VII 1966 г.

ссылка на эту страницу

Вопросу изолирования, обнаружения и определения аминазина и его метаболитов в объектах биологического происхождения посвящено большое число отечественных и зарубежных работ. Токсикология, метаболизм и методы изолирования, обнаружения и определения неизмененных производных фенотиазина (аминазина и др. ) и их метаболитов в жидкостях и тканях человека и животных рассмотрены нами в предыдущих сообщениях.1

Основным методом изолирования и определения аминазина (ларгактила, хлорпромазина и др. ) в 5—10 г органов, 20 мл мочи и 5 мл крови человека и животных до настоящего времени является метод Дюбо и Паскаля, основанный на экстракции основания аминазина эфиром из щелочной среды, последующей реэкстракции в 0, 1 н. растворе серной кислоты и количественном определении по реакции с концентрированной серной кислотой. Для определения общего количества аминазина в крови (свободная и связанная формы) авторы применили кислотный гидролиз, достигаемый при нагревании с соляной кислотой (удельный вес 1, 19), а для анализа мочи — щелочной гидролиз, проводимый при нагревании в течение 2 часов с 20% раствором карбоната натрия при 100°.

Curry описал видоизмененный метод Дюбо и Паскаля для изолирования и определения производных фенотиазина в крови и ткани печени. Навеску печени мацерируют 10 мл воды и 13, 5 мл соляной кислоты, а навеску крови обрабатывают 2 мл воды и 8 мл соляной кислоты. Смесь нагревают на кипящей водяной бане в течение 5 мин., охлаждают льдом, отделяют кислотный слой и смешивают с 12 мл 60% раствора едкого кали. Охлажденный щелочной раствор двукратно (по 50 мл) извлекают эфиром. Эмульсию расслаивают центрифугированием, эфирные извлечения отделяют, объединяют и встряхивают с 10 мл 2,5% раствора едкого натра, затем с 10 и 5 мл воды и реэкстрагируют 5 мл 0, 1 н. раствора серной кислоты. Сернокислый слой отделяют и после улетучивания следов эфира снимают ультрафиолетовый спектр в диапазоне волн от 220 до 320 ммк. Производные фенотиазина имеют максимум абсорбции при 255 ммк. Метаболиты аминазина в форме сульфоксидов могут давать максимум абсорбции при 240, 275 и 300 ммк. С реактивом FPN 2 производные фенотиазина и их метаболиты образуют красное, пурпурное, голубое или зеленое окрашивание.

Clarke отметил, что производные фенотиазина можно изолировать из внутренних органов методом Стас—Отто. Этим методом В.С. Гольденберг и Я.З. Лемберский изолировали аминазин и дипразин из внутренних органов человека. При этом аминазин открывали в, хлороформном извлечении из аммиачной среды, а дипразин — в извлечениях из кислой и аммиачной среды, но лучше из последней.

Л.И. Ушакова для изолирования аминазина из трупного материала применяла экстракцию ацетоном из тканей, предварительно измельченных и растертых с безводным сульфатом натрия (1:3). После упаривания ацетона остаток обрабатывали водой, водную фазу отфильтровывали и дважды извлекали новыми порциями эфира, затем водный слой подщелачивали раствором аммиака и трижды извлекали хлороформом. Аминазин обнаруживали в остатках после упаривания хлороформного извлечения из аммиачного раствора. Аминазин из крови (5 г) экстрагировали по методу Дюбо и Паскаля.

Для обнаружения аминазина (в остатках после упаривания аммиачно-хлороформных извлечений) применяли следующие методы: 1) реакции с общеалкалоидными осадочными реактивами — Майера, Зонненштейна и Драгендорфа; 2) реакции окрашивания с концентрированными серной, азотной кислотами, реактивами Марки, Фреде, бромной водой, раствором хлорного железа, концентрированной серной кислотой и нитритом натрия, концентрированной соляной кислотой и нитратом натрия; 3) инфракрасную спектроскопию.

Аминазин при исследовании крови по методу Дюбо и Паскаля определяли визуально (стандартные шкалы).

Рассмотренные методы изолирования аминазина из трупного материала в основном охарактеризованы для определения аминазина в незначительных навесках, и поэтому во многих случаях они не могут быть использованы при судебно-химических исследованиях. Описанные методы изолирования из 100 г навесок органов применяли без установления оптимальных условий извлечения и экстракции аминазина, без изучения границ обнаружения и определения, специфичности реакций обнаружения и т.д. Таким образом, разработка оптимального метода изолирования и обнаружения аминазина представляет практический интерес.

Экспериментальная часть

Нами было показано, что аминазин не экстрагируется эфиром из кислой среды (pH 2, 0—3, 0 по универсальному индикатору), а экстрагируется им в форме основания только из щелочной среды, наиболее полно при pH 13, 0 (при подщелачивании 50—60% раствором едкого натра). Использование хлороформа, дихлорэтана и других галогенопроизводных для экстракции приводит к образованию стойких эмульсий, потерям при экстракции и исключает реэкстракцию аминазина в сернокислую фазу (что необходимо для очистки и количественного определения).

Для разработки наиболее рационального метода изолирования из трупного материала мы подвергли сравнительному изучению 4 наиболее часто применяемых метода изолирования и экстракции органических соединений: методы Дюбо и Паскаля, Васильевой, Крамаренко и Стас—Отто.

Изолирование по методу Дюбо и Паскаля. Мелкоизмельченные 100 г печени, содержащие определенное количество аминазина, через 2 суток заливали 100 мл дистиллированной воды и 135 мл концентрированной соляной кислоты, смешивали и нагревали на кипящей водяной бане 5 мин. при постоянном помешивании, затем охлаждали льдом и фильтровали. К солянокислому извлечению добавляли 120 мл предварительно промытого эфиром 60% раствора едкого натра. Охлажденный раствор (pH 12, 0—13, 0) трижды извлекали новыми порциями (по 100 мл) эфира. Эмульсию центрифугировали и эфирный слой отделяли. Объединенные эфирные извлечения встряхивали с 30 мл 2,5% раствора едкого натра, отмывали 30 и 15 мл дистиллированной воды и реэкстрагировали 0, 1 н. раствором серной кислоты. Сернокислотный слой отделяли и после улетучивания следов эфира объем доводили в мерной колбе до 50 мл 0, 1 н. раствором серной кислоты. Количество аминазина определяли по методу Дюбо и Паскаля в модификации Л.И. Гребенника с использованием фотоэлектроколориметра ФЭКН-57 [кювета 5,105, светофильтр №4 (ЛЯМБДА=508 ммк), эталон сравнения — контроль реактивов]. Результаты опытов приведены в табл. 1. (В первых 5 опытах подщелачивание солянокислого извлечения производили 60% раствором едкого натра до pH 12, 0—13, 0, в последующих — 20% раствором карбоната натрия до pH 9,0—10,0).

Таблица 1

Изолирование по методу Дюбо и Паскаля

Добав­лено (в мг)

Выде­лено

Сред­нее ариф­ме­тичес­кое (в мг)

% извле­че­ния

 

Условия экстра­гиро­вания

в мг

В %

10

10

10

10

10

0,52

0,35

0,70

0,55

0,36

5,2

3,5

7,0

5,5

3,6

0,496

4, 96

Соляно­кислое извле­чение подщела­чивали 60% раствором едкого кали до pH 13, 0

Кон­троль­ные опыты (1-5)

0

0

Окраши­вания с концентри­рованной серной кислотой не наблюдалось

10

10

10

10

10

0, 32

0, 30

0, 45

0, 30

0, 36

3, 2

3,0

4,5

3,0

3,6

0, 346

3, 46

Соляно­кислое извлечение подщела­чивали 20 % раствором карбоната натрия

Кон­троль­ные опыты (6-10)

0

0

Окраши­вания с концен­три­рованной серной кислотой не наблю­далось

Максимальное количество аминазина экстрагируется из растворов, обработанных 60% раствором едкого натра до pH 13, 0. Но при этом извлекают не более 7% аминазина, содержащегося в исследуемой навеске печени. При подщелачивании солянокислых растворов карбонатом натрия до pH 9, 0—10, 0 аминазин извлекают только в пределах 3—4,5%. Метод Дюбо и Паскаля не может быть рекомендован для использования в экспертной практике.

Изолирование по методу Васильевой. Мелкоизмельченные 100 г печени заливали 200 мл дистиллированной воды (к печени было заранее добавлено определенное количество аминазина — в пересчете на основание), подкисляли 10% раствором щавелевой кислоты до pH 2,0—3,0. Через 2 часа кислое водное извлечение отфильтровывали в делительную воронку, органы и фильтр промывали небольшим количеством подкисленной воды (pH 2,0—3,0). Промывные воды присоединяли к основному извлечению, двукратно экстрагировали эфиром, затем подщелачивали 25% раствором аммиака до pH 9, 0—10, 0 и трижды экстрагировали равными порциями эфира (общий объем эфира равнялся объему водной фазы). Эфирные извлечения объединяли и упаривали в чашке при температуре 30—40°. Маслянистый остаток растворяли в 10 мл 0,1 н. раствора серной kислоты и через 30 мин. проводили количественное определение выделенного аминазина по методике, приведенной выше. Одновременно проводили изолирование тем же методом, но подщелачивали водное извлечение 60% раствором едкого натра до pH 13, 0. Результаты приведены в табл. 2.

Таблица 2

Изолирование по методу Васильевой

Добав­лено (в мг)

Выде­лено

Сред­нее ариф­мети­чес­кое (в мг)

% из­вле­че­ния

Усло­вия экстра­гиро­ва­ния

в мг

В %

10

10

10

10

10

0,28

0,5

0,7

0,6

0,4

2,8

5,0

7,0

6,0

4,0

0,495

4,95

Кислое водное извлече­ние подщела­чивали 25% раство­ром аммиака до pH 9,0—10,0

Кон­троль­ные опыты (1-5)

0

0

Окраши­вания с концен­трирован­ной серной кислотой не наблюда­лось

10

10

10

10

10

1,43

1,45

1,55

1,6

1,375

14,3

14,5

15,5

16,0

13,75

1,48

14,8

Кислое водное извлечение подщела­чивали 60% раствором едкого натра до pH 13,0

Кон­троль­ные опыты (6-10)

0

0

Окраши­вания с концен­триро­ванной серной кислотой не наблю­далось

Как видно из табл. 2, аминазин экстрагируется в пределах 3—7%, но при использовании в качестве щелочного агента едкого натра удается извлечь до 16% аминазина, т.е. в, 2—5 раз больше. Чтобы выяснить влияние кислоты на полноту изолирования из внутренних органов по методу Васильевой, водное извлечение подкисляли 25% раствором серной кислоты до pH 2, 0—3, 0. Результаты приведены в табл. 3.

Таким образом, изолирование из трупного материала по методу Васильевой происходит более полно при подкислении водного извлечения 25% раствором серной кислоты до pH 2,0—3,0 и последующей экстракции аминазина в форме основания из щелочной среды при pH 13, 0; при извлечении из трупного материала для подкисления водного извлечения следует применять не 10% раствор щавелевой кислоты, а 25% раствор серной кислоты, так как при этом извлекается до 30% аминазина.

Таблица 3

Влияние кислоты на извлечение по методу Васильевой

Добав­лено (в мг)

Выде­лено

Сред­нее ариф­мети­ческое (в мг)

% извле­чения

Усло­вия экстра­гиро­вания

в мг

в %

10

2,99

29,9

2,57

25,7

Водное извле­чение подкис­ляли 25% раство­ром серной кислоты и подщела­чивали 60% раство­ром едкого натра

10

2,00

20,0

10

3,01

30,1

10

2,18

21,8

10

2,68

26,8

Кон­троль­ные опыты (1-5)

0

0

Окраши­вания с концен­трирован­ной серной кислотой не наблю­далось

Изолирование по методу Крамаренко. Мелко. измельченные 100 г печени заливали 0,02 н. раствором серной кислоты в количестве, обеспечивающем создание зеркала ее толщиной не менее 0,5 см, перемешивали и с помощью универсального индикатора устанавливали pH 2,0—3,0. Смесь периодически перемешивали в течение 2 часов, процеживали через марлю и еще дважды извлекали в течение 1 часа новыми порциями 0,02 н. раствора серной кислоты.

Кислые извлечения объединяли и центрифугировали, надосадочные жидкости сливали, осадок заливали 0,02 н. раствором серной кислоты (pH 2,0—3,0), перемешивали, настаивали в течение 1 часа, вновь центрифугировали и присоединяли жидкость к первоначальному извлечению. Объединенные извлечения насыщали сульфатом аммония и оставляли на 2 часа. Выделившийся осадок отделяли центрифугированием, жидкость отфильтровывали, pH ее доводили до 2, 0—3, 0 и дважды (порциями по 50 мл) извлекали эфиром. К кислой водной вытяжке осторожно добавляли 20% раствор едкого натра до pH 9, 0—10, 0 и трижды экстрагировали хлороформом. Для каждой экстракции брали объем хлороформа, равный 1/3 объема водной фазы. Хлороформные вытяжки соединяли, фильтровали и упаривали на водяной бане при 30—40°. Маслянистый остаток после упаривания растворяли в 10 мл 0,1 н. раствора серной кислоты и через 30 мин. производили количественное определение по методике, приведенной выше. Результаты опытов приведены в табл. 4. Затем проводили аналогичное извлечение из трупного материала, но сернокислое извлечение подщелачивали не 20%, а 60% раствором едкого натра до pH 13,0, а основание аминазина экстрагировали не хлороформом, а эфиром (также троекратно).

Как видно из табл. 4, метод Крамаренко дает самый низкий выход аминазина и поэтому непригоден для изолирования аминазина из трупного материала. По-видимому, значительное количество аминазина сорбируется сульфатом аммония и белковыми веществами кислого водного извлечения.

Изолирование по методу Стас — Отто. Мелкоизмельченные 100 г печени трижды (объемами по 200 мл) извлекали 96° спиртом при pH 2, 0—3, 0 (подкисляли 10% раствором щавелевой кислоты). Каждый раз через сутки спиртовые извлечения отфильтровывали. Объединенные спиртовые извлечения упаривали на водяной бане (при 60°) до густоты сиропа. Белковые вещества 3 раза осаждали 96° или абсолютным спиртом. Остаток после упаривания обрабатывали 50 мл дистиллированной воды (40°), раствор количественно отфильтровывали в делительную воронку. Кислую водную фазу (pH 2, 0— 3, 0) дважды (объемами по 20 мл) экстрагировали эфиром, извлечения отфильтровывали, объединяли и упаривали при 40°. Кислую водную фазу подщелачивали 25% раствором аммиака до pH 9, 0—10, 0 или 60% раствором едкого натра до pH 13, 0 и извлекали эфиром (4 раза по 20 мл). В опытах, результаты которых представлены в табл. 5, аммиачные эфирные извлечения отфильтровывали, упаривали при 40°, маслянистый остаток растворяли в 10 мл 0, 1 н. раствора серной кислоты и после получасового настаивания определяли аминазин; щелочные эфирные извлечения соединяли и дробно реэкстрагировали 0,5 н. раствором серной кислоты (10, 10, 10, 10 и 5 мл), каждый раз по 5 мин. После улетучивания следов эфира из сернокислого реэкстракта объем его доводили до 50 мл с помощью 0,5 н. раствора серной кислоты и определяли выделенный аминазин по методике, приведенной выше.

Из результатов проведенных опытов (см. табл. 1—5) следует, что наиболее рациональным является метод Стас — Отто с внесенными нами изменениями — подкислением спиртового извлечения до pH 2, 0—3, 0 спиртовым раствором (10%) щавелевой кислоты, а экстракция аминазина в форме основания при pH 13, 0 с последующей реэкстракцией: в 0,5 н. растворе серной кислоты.

Границы обнаружения и определения аминазина предложенным нами методом представлены в табл. 6.

Таблица 4

Изолирование по методу Крамаренко

Добав­лено (в мг)

Выде­лено

Сред­нее ариф­мети­чес­кое (в мг)

% из­вле­че­ния

Усло­вия экстра­гиро­вания

в мг

В %-

10

10

10

10

10

0,11

0,19

0,17

0,15

0,10

1,1

1,9

1,7

1,5

1,0

0, 144

1, 44

Серно­кислое извлече­ние подщела­чивали 20% раствором едкого натра до pH 9, 0 — 10,0 и троекратно экстраги­ровали хлороформом

Кон­троль­ные опыты (1—5)

0

0

Окраши­вания с концен­трированной серной кислотой не наблюдалось

10

10

10

10

10

0,18

0,11

0,10

0,17

0,15

5

0, 142

1, 42

Сернокислое извлечение подщела­чивали 60 % раство­ром едкого натра и троекрат­но экстраги­ровали эфиром

Кон­троль­ные опыты (6—10)

0

0

Окраши­вания с концен­трирован­ной серной кислотой не наблю­далось

Таблица 5

Изолирование по методу Стас—Отто

Добав­лено (в мг)

Выде­лено

Среднее арифме­тичес­кое

Усло­вия экстра­гиро­вания

в мг

В %

в мг

в %

10

10

10

10

10

3,59

3,20

4,11

4,20

4,25

35,9

32,0

41,1

42,0

42,5

3,87

38,7

Подкис­ляли 10% раство­ром щавеле­вой кисло­ты до pH 2, 0—3, 0, а подщела­чивали 25% раствором аммиака до pH 9, 0-10, 0

Кон­троль­ные опыты (1—5)

0

0

Окраши­вания с концен­три­рован­ной серной кисло­той не наблю­далось

10

10

10

10

10

4,6

5,05

4,88

5,25

5,13

46,0

50,5

48,8

52,5

51,3

4,98

49,8

Подкис­ляли 10% раство­ром щаве­левой кислоты, а под­щела­чивали 60% раствором едкого натра до pH 13,0

Кон­троль­ные опыты (6—10)

0

0

Окраши­вания с концен­трирован­ной серной кислотой не наблю­далось

10

10

10

10

10

3,6

3,65

3,3

3,6

3,35

36,0

36,5

33,0

36,0

33,5

3,5

35,0

Под­кис­ляли 20% раство­ром соляной кислоты, а под­щела­чивали 60% раство­ром едкого натра до pH 13,0

Кон­троль­ные опыты

(11-15)

0

0

Окраши­вания с концен­трирован­ной серной кисло­той не наблю­далось

10

10

10

10

10

3,30

3,15

2,82

3,16

2,94

33,0

31,5

28,2

31,6

29,4

3,07

30,7

Подкис­ляли 20 % раство­ром серной кислоты, а под­щела­чива­ли 60% раство­ром едкого натра до pH 13, 0

Кон­троль­ные опыты

(16—20)

0

0

Окра­шива­ния с кон­центри­рован­ной серной кислотой не наблю­далось

Таблица 6

Границы обнаружения аминазина в трупном материале модифицированным методом Стас—Отто

Добав­лено (в мг)

Выде­лено

Среднее арифмети­ческое

Приме­чание

в мг

в %

в мг

В %

3,0

0,475

15,8

0,37

12, 3

3,0

0,29

9,6

3,0

0,34

11,3

1,0

0,147

14,7

0,16

16, 0

1,0

0,16

16,0

1,0

0,17

17,0

0,5

0,096

19,2

0,092

18, 4

0,5

0,091

18,2

0,5

0,09

18,0

Кон­троль­ные опыты (1—9)

0

0

Окра­ши­вания с концен­три­рован­ной серной кисло­той не наблю­далось

Граница обнаружения составляет 0,2 мг, граница определения — 0,5 мг.

 

Выводы

  1. Проверено и охарактеризовано 4 метода изолирования аминазина из трупного материала.
  2. Разработан метод изолирования, обнаружения и определения аминазина в трупном материале. Граница обнаружения составляет 0,2 мг, граница определения — 0,5 мг основания аминазина в 100 г трупного материала. Метод позволяет выделять до 52,5% добавленного к. органам аминазина.

 

1 Аптечное дело, 1965, № 4; Судебно-медицинская экспертиза, 1966, № 1.

2 Для приготовления реактива смешивают 45 частей 20% раствора хлорной кислоты, 50 частей 50% раствора азотной кислоты и 5 частей 5% раствора хлорида окисного железа.

похожие статьи

Изучение распределения неостигмина метилсульфата в организме теплокровных животных после внутрижелудочного введения / Алехина М.И., Шорманов В.К., Никитина Т.Н., Маркелова А.М. // Судебно-медицинская экспертиза. — М., 2019. — №2. — С. 40-47.

Обнаружение 25B-NBOMe — производного фенилэтиламина в биологическом материале / Барсегян С.С., Кирюшин А.Н., Ерощенко Н.Н., Туаева Н.О., Носырев А.Е., Кирилюк А.А. // Судебно-медицинская экспертиза. — М., 2019. — №2. — С. 34-39.

Особенности распределения 2,4- и 2,6-ди-трет-бутилгидроксибензола в организме теплокровных животных / Шорманов В.К., Цацуа Е.П., Асташкина А.П. // Судебно-медицинская экспертиза. — М., 2019. — №1. — С. 36-42.

Разработка методик изолирования, обнаружения и количественного определения алимемазина в биологических жидкостях лабораторных животных при острых отравлениях / Рыбасова А.С., Ремезова И.П., Любченко Д.А., Светличная Е.В., Авраменко Н.С. // Судебно-медицинская экспертиза. — М., 2019. — №1. — С. 31-35.

Разработка и валидация методики ферментативного гидролиза для изолирования токсических веществ из неокрашенных волос / Слустовская Ю.В., Стрелова О.Ю., Куклин В.Н. // Судебно-медицинская экспертиза. — М., 2019. — №1. — С. 24-30.

больше материалов в каталогах

Судебно-химические исследования