Применение хроматографии на бумаге при доказательстве стрихнина в биологическом материале

Выделение алкалоидов из биологического материала подкисленным спиртом связано с многочисленными операциями по очистке, которые ведут к большим потерям искомого вещества и требуют много времени. Изолирование подкисленной водой позволяет сократить время, но анализ без очистки ненадежен, особенно при работе с несвежим объектом. Проведение очистки повторными извлечениями из различных сред также приводит к большим потерям вещества. Мы применили хроматографию на бумаге для очистки извлеченного алкалоида с последующим его качественным и количественным определением. В эксперименте использован стрихнин как сравнительно химически стойкий алкалоид.

Мы остановились на наиболее приемлемой для большинства алкалоидов системе н-бутанол — СН₃СООН—Н₂0 (4:1:5) и работали с бумагой (без пропитывания ее солями) методом восходящей хроматографии. Проявитель — модифицированный реактив Драгендорфа. Работа проводилась с 0,1% раствором нитрата стрихнина. Прежде всего была установлена чувствительность реактива Драгендорфа как проявителя. Для этого на бумагу с помощью микропипетки объемом 0, 1 мл наносили разные количества соли стрихнина. После хроматографирования, просушки и обработки реактивом Драгендорфа фиксировали первое видимое пятно, которое, как показали опыты, появляется в случае нанесения 4 мкг соли стрихнина. Это в пересчете на основание алкалоида составляет 3, 4 мкг. Чтобы выяснить лучший растворитель для элюирования, мы обработали рядом различных жидкостей зоны стрихнина на хроматограммах, устанавливая их методом «свидетеля». Настаивали дважды по часу и для сравнения оставляли в растворителе на ночь. Затем испаряли и с остатком проводили реакцию на стрихнин с серной кислотой и бихроматом калия. Результаты приведены в табл. 1.

Лучшим растворителем оказался метанол. Элюирование им дает возможность обнаружить стрихнин в количестве 17 мкг (основания).

Таблица 1

Элюирование разными растворителями

Настаивание в течение суток не изменило результаты, поэтому в дальнейшем мы производили его двукратно по часу. Для количественного определения стрихнина использовали колориметрический метод на основе реакции Дениже—Малакена в модификации Н.Н. Вестфаль (восстановление стрихнина и взаимодействие с NaNO₂). Работу проводили на ФЭК-М. На хроматографическую бумагу наносили 15—200 мкг алкалоида; элюированный метанолом стрихнин определяли количественно, строя калибровочную кривую (для 1—10 мкг стрихнина в 1 мл).

Было установлено, что смыть метанолом и определить указанным выше методом можно до 88% нанесенного стрихнина.

Полученные данные проверяли на биологических объектах. Брали свежий и загнивший (выдержанный при комнатной температуре в течение 10—14 дней) материал. К 50—100 г почек или печени добавляли 2,5—4,5 мг стрихнина основания. Через сутки объект заливали водой (1:2), подкисляли 5% раствором щавелевой кислоты и настаивали дважды по 2 часа (при pH 3,0). Одну часть извлечений из свежего объекта анализировали по методике Васильевой, другую очищали высаливанием сульфатом натрия. Извлечение без высаливания или фильтрат после высаливания подщелачивали 1 н. раствором NH₄OH (до pH 9, 0) и взбалтывали с хлороформом. Хлороформ отгоняли и производили количественное определение стрихнина (табл. 2).

В процессе работы отмечено, что при проведении количественного определения остаток без высаливания сильно вспенивается (при восстановлении), что приводит к потерям алкалоида. Кроме того, взбалтывание с хлороформом образует стойкую эмульсию, расслоение которой требует много времени. Эти недостатки особенно ощутимы при загнившем материале.

Таблица 2

Результаты определения стрихнина в свежем объекте

Мы установили также, что высаливание сульфатом натрия почти не влияет на количественный выход стрихнина и, если проводилась очистка остатка после удаления хлороформа, улучшает его. Однако высаливание не приводит к полной очистке, и при загнившем объекте после удаления хлороформа остаток интенсивно окрашен.

Для очистки хлороформного извлечения из загнившего объекта применили хроматографию на бумаге. Хлороформное извлечение упаривали до небольшого объема (2— 3 мл), замеряли и брали микропипеткой 0, 2—0, 3 мл для хроматографирования. Время проявления хроматограммы 14—16 часов. Зону хроматограммы устанавливали методом «свидетеля», проявляя реактивом Драгендорфа. Элюировали метанолом и производили качественное и количественное определение. (табл. 3).

Из табл. 3 видно, что применение хроматографии на бумаге дает хорошие результаты количественного определения. Извлечение очищается настолько, что после элюирования и удаления растворителя остается бесцветный остаток, в котором легко доказывается стрихнин.

Таблица 3

Результаты определения стрихнина в загнившем объекте с применением для очистки хроматографии на бумаге

Таким образом, в процессе работы установлено, что фильтрование водного извлечения через бумажный фильтр и разрушение эмульсии приводят к большим потерям алкалоида (удается обнаружить 8—14% стрихнина). Большие потери стрихнина происходят и при высаливании, если фильтрование начинать тотчас после появления осадка: образуется такая же стойкая, трудно расслаиваемая эмульсия. Быстрого разделения эмульсии можно достичь, если процесс высаливания идет несколько часов. Хорошие результаты (см. табл. 3) можно получить, если извлечение фильтровать через двойной слой марли, затем добавлять 50 г сульфата натрия (при анализе 100 г объекта и двукратном извлечении) и оставлять на ночь, после чего фильтровать через бумажный фильтр, тщательно промывая осадок подкисленной водой. Извлечение стрихнина нужно вести только из щелочного раствора.

Выводы

1. Предлагается методика определения стрихнина в биологическом материале с применением хроматографии на бумаге для его очистки. Метод обладает достаточной чувствительностью и особенно перспективен для анализа загнившего материала.
2. Определена чувствительность реактива Драгендорфа при проявлении стрихнина на хроматограмме (3,4 мкг) и подобран лучший растворитель для элюирования (метиловый спирт).