Использование методики фазово-контрастной микроскопии для установления кровоизлияний на гнилостно измененных тканях

Определение прижизненности и давности образования механических повреждений является одной из актуальных проблем судебной медицины. Если ткани трупа находятся в состоянии гнилостных изменений, диагностика прижизненности и давности образования кровоизлияний многократно усложняется. Это связано с изменениями, происходящими под воздействием протеолитических ферментов. При аутолизе отмечается набухание цитоплазмы клеток, увеличение ее абсолютных размеров, ядра клеток становятся светлее и уменьшаются в размерах. По мере дальнейшего набухания цитоплазмы границы клеток становятся нечеткими, цитоплазма приобретает зернистый вид. Процесс набухания клеток сменяется их сморщиванием и уменьшением их абсолютных размеров, при этом увеличивается интенсивность восприятия цитоплазмой кислых красителей.

В состоянии выраженных гнилостных изменений клетка утрачивает способность к окрашиванию.

Микроскопию препаратов с аутолитическими и гнилостными изменениями проводят под малым и большим увеличением для выявления характерных структур и определения принадлежности тканей и органов, представленных на исследование.

В коже аутолитические изменения, прежде всего, возникают в железистых образованиях кожи (сальных и потовых железах), затем в эпидермисе. Волокнистые структуры более устойчивы к аутолизу. В эпидермисе отмечается нечеткость границ между клетками, базофилия цитоплазмы, бледная окраска ядер.

В скелетной мускулатуре по мере разрешения трупного окоченения выявляются аутолитические изменения в виде помутнения, зернистости и гомогенизация миоплазмы. Ядра в данном случае подвергаются лизису.

В сосудах отмечается разрыхление и набухание интимы. Ядра пикнотичные либо лизированные. В эритроцитах выщелачивается гемоглобин и они слабо окрашиваются эозином, контуры их некоторое время сохраняются, затем представляют собой сетчатые структуры, а при выходе гликогена контуры эритроцитов не различаются.

Судебно-медицинское значение гистологического исследования гнилостно изменённых тканей ограничивается не только определением органной и тканевой принадлежности, но и возможностью определения прижизненности кровоизлияний. Для выявления кровоизлияний в гнилостных тканях используется методика окраски по Лепене. Данная методика основана на выявлении пероксидазной активности гемоглобина в тканях путем окрашивания срезов раствором бензидина и перекиси водорода, эритроциты и гемоглобин при данной окраске должны окраситься в темно-коричневый цвет. На практике гемоглобиновый пигмент красится в желто-коричневый, буро-коричневый, желто-зеленый цвета. Цитоплазма красится в бледно-серо-голубой и бледнобежевой цвет. При резко выраженных гнилостных изменениях тканей, обильной гнилостной бактериальной и грибковой микрофлоре может быть получена ложноотрицательная реакция по Лепене (отрицательная окраска при имеющем место кровоизлиянии). Таким образом, в настоящее время нет совершенных методик, позволяющих выявлять кровоизлияния в тканях, подверженных гнилостным изменениям.

Нами получен положительный опыт применения фазово-контрастной микроскопии при исследовании кровоизлияний на гнилостно измененных тканях. Применение данного метода позволяет выявить не только наличие в тканях кровоизлияний, но и степень их выраженности. Метод фазового контраста основан на том, что фазовая скорость света обратно пропорциональна показателю преломления. Фаза луча, проходящего через объект с более высоким показателем преломления, чем у окружающей среды, будет запаздывать по сравнению с фазой того луча, который проходит только через среду. Глаз не способен воспринимать фазовые изменения света. Поэтому прозрачные, неконтрастные объекты при обычном микроскопическом исследовании остаются невидимыми. В фазово-контрастном микроскопе специальный конденсор и особо устроенный объектив регулируют изменения фазы световых волн и превращают разность фаз в разность интенсивностей света, благодаря чему детали строения объекта становятся доступными для глаза. Система колец в конденсоре и объективе отделяет те лучи, которые диафрагмировали (отклонились) на объекте, от тех, которые не диафрагмировали. После того как диафрагмировавшие лучи проходят через фазовую пластинку объектива, вносящую дополнительный сдвиг по фазе, они рекомбинируются с недиафрагмировавшими лучами. Именно таким образом удается резко повысить контраст клеток или внутриклеточных структур. При гнилостных изменениях тканей фазово-контрастная микроскопия позволяет облегчить определение принадлежности тканей, их структуру.

Рис.1. Очаг геморрагического пропитывания в межуточной строме. Окраска гематоксилин-эозином (слева).

Рис.1. Очаг геморрагического пропитывания в межуточной строме. Окраска по Лепене (справа)

Рис. 2. Очаг геморрагического пропитывания в межуточной строме.
Фазово-контрастная микроскопия

В ноябре 2018 года в лабораторию поступил материал из трупа, который находился в земле с 2017 года. Его органы и ткани находились в состоянии выраженных гнилостных изменений. При стандартной окраске тканей и органов в одном из микропрепаратов обнаружены очаги буроватого прокрашивания, напоминающие кровоизлияния. Волокнистые структуры были окрашены в грязно-розовато-сиреневый цвет, клеточно-ядерное строение не определялось, в окружности расширенных и полнокровных сосудов среднего калибра были отмечены мелкие очажки геморрагического пропитывания в межуточной строме, вне связи с сосудами. Реакция по Лепене была представлена в виде очаговых бледно-коричневых мелкозернистых масс, слабо различимых на общем светложелтом фоне (рис. 1). При фазово-контрастной микроскопии кровоизлияния были представлены зернистыми массами, которые хорошо контурировались по отношению к окружающим тканям (рис. 2).

Данный пример наглядно показывает, что фазово-контрастное исследование в гнилостно измененных и поврежденных тканях помогает:

• определить расположение кровоизлияний в ткани;

• определить объем инфильтрации тканей эритроцитами (прижизненность).

Применение данного метода также позволяет экономить на окрасках микропрепаратов, заменяя их использование фазово-контрастным методом, что в условиях недостаточного финансирования гистологических отделений позволяет расставить приоритеты при плановых закупках материалов и реагентов.