Определение ртути по дитизонату при судебно-химическом анализе органов человека

В 1962 году нами разработан для судебно-химических целей метод определения ртути в органах человека, обладающий достаточной чувствительностью и точностью и позволивший сократить время анализа до 2—4 ч. Недостатками метода являются визуальная оценка окраски колориметрируемого осадка и большая затрата времени на анализ.

Поэтому поставили задачу ускорить процесс разложения тканей и разработать быстрый инструментальный метод определения ртути с поверочной качественной реакцией на ртуть.

Деструкция ткани печени

Применяемый в судебно-медицинских лабораториях метод деструкции тканей органов при анализе на ртуть основан на каталитической реакции разложения азотной кислоты в присутствии серной. Катализатор — этанол. Разложение тканей происходит за счет выделения свободных окислов азота и тепла реакции.

Не изменяя принципа деструкции, мы пытались добиться большей глубины ее и ускорения за счет дополнительного введения окислителей: 42% раствора хлорной кислоты, пергидроля и перманганата калия. Однако получить бесцветный деструктат в короткое время нам не удалось.

Углубления и ускорения деструкции мы достигли, увеличив количество серной кислоты в реакции и введя хлорную кислоту, которая является сильным окислителем в горячих концентрированных растворах. В разбавленных растворах при комнатной температуре она теряет окислительную способность (Ф. Коттон, Дж. Уилкинсон, 1969). Поэтому введенная хлорная кислота в начале деструкции действует как сильный окислитель, а после окончания деструкции остаточное количество ее уже не мешает в дальнейшем определению ртути.

В процессе работы выяснилось, что увеличение количества серной кислоты при деструкции без хлорной кислоты также ведет к ускорению и углублению процесса деструкции, но в меньшей степени.

При использовании в реакции хлорной кислоты и увеличении количества серной кислоты деструктат все же остается окрашенным в желтый цвет, но остаток жира значительно уменьшается — до небольшой пленки на поверхности. Время деструкции сокращается до 20 мин, при этом можно использовать большие навески органов, что позволяет повысить границу определения ртути.

Разработано два варианта деструкции. 1-й вариант. К 20-50 г измельченной печени (или другого органа) добавляли 1 мл этанола, 5 мл воды, 10—15 мл (соответственно навеске) концентрированной азотной кислоты и 20 мл концентрированной серной кислоты небольшими порциями, не допуская бурной реакции с обильным выделением окислов азота. По окончании добавления серной кислоты прибавляли 10 мл 42% раствора хлорной кислоты и нагревали в течение 10 мин на кипящей водяной бане. Добавляли 50 мл кипящей воды и фильтровали в колбу, содержащую 20 мл насыщенного раствора мочевины для связывания свободных окислов азота. Фильтр с остатком промывали 1—2 раза кипящей водой. В остывшей жидкости определяли ртуть.

2-й вариант. Деструкцию производили в тех же условиях, но без добавления хлорной кислоты.

Определение ртути

При исследовании деструктата целесообразно использовать экстракционные реакции на ртуть, позволяющие выделить ртуть из кислого окрашенного деструктата в небольшой объем органического растворителя, что дает возможность сконцентрировать ее и повысить границу определения.

Среди экстракционных реакций для исследования биологического материала на ртуть более 20 лет широко используется дитизон (Е. Сендел, 1964; З. Марченко, 1971).

Достоинством дитизона как реагента на ртуть являются высокая чувствительность (0,01 мкг/мл) и достаточно высокая избирательность. Определению ртути в кислой среде мешают серебро, золото, платина, палладий (Г. Иванчев, 1961), которые, однако, являются исключительно редкими объектами исследования в судебной токсикологии.

Недостатком дитизона как реагента на ртуть является легкая окисляемость его не только в щелочной, но и в кислой среде под влиянием окислителей и прямого солнечного света. При этом образуются продукты окисления дитизона (дифенилкарбодиазон и др.), окрашенные в желтый цвет и растворимые в четыреххлористом углероде и хлороформе. Не только окраска, но и максимум поглощения их (390—470 нм) лежит близко к однозамещенному дитизонату ртути (485 нм).

В связи с этим недостатком для замены дитизона было синтезировано более 70 его аналогов, но ни один из них не нашел такого широкого применения, как дитизон. Используемый в отдельных случаях 1,5-ди-β-нафтилкарбазон не имеет существенных преимуществ перед дитизоном.

Определение ртути в виде дитизоната, как правило, используется для десятков микрограммов ее и менее. Так как при химико-токсикологических исследованиях диапазон определяемой ртути в органах человека сильно колеблется, то мы предварительно проверили на водных растворах возможность экстракции и определения ртути в широком диапазоне (от 1 мкг до 1 мг) методом одноцветной окраски по однозамещенному дитизонату ртути. Экстракцию проводили хлороформом и четыреххлористым углеродом.

Методика. К раствору ртути в 20 мл 4 н. раствора серной кислоты добавляли 10 мл 10% раствора сернокислого гидроксиламина, 5 мл четыреххлористого углерода и 0,3 мл и более раствора свежеочищенного дитизона ¹ при легком встряхивании до получения устойчивого изумрудно-зеленого окрашивания органической фазы. Затем производили энергичную экстракцию в течение 30 с. При изменении окраски органической фазы на желтую или оранжево-желтую отделяли органическую фазу и повторяли экстракцию до получения устойчивого зеленого окрашивания. Экстракты собирали под слой 1 н. раствора трихлоруксусной кислоты, промывали водой, а затем 1 % раствором гидроокиси аммония до получения бесцветной водной фракции. Полученный экстракт дитизоната ртути освобождали от воды отстаиванием в течение 5 мин в темном месте. Измеряли объем экстракта и плотность на фотоколориметре ФЭКН-57 в кювете с толщиной поглощающего слоя 10 мм при длине волны 485 нм по отношению к четыреххлористому углероду. Экстракцию хороформом производили так же.

Закону Ламберта — Бера подчиняются концентраций ртути 0,05—5 мкг/мл.

Результаты опытов представлены в табл. 1.

Опыты показали, что ртуть из сернокислых растворов экстрагируется как четыреххлористым углеродом, так и хлороформом достаточно полно при широком диапазоне концентрацией в экстрагируемом объеме — от 0,001 до 2 мг. Затрата времени на экстракцию и определение — от 15 до 30 мин.

Таблица 1

Определение ртути в сернокислых растворах по дитизонату (n= 6)

Примечание. Здесь и в табл. 2 х — среднее арифметическое; S_x — среднее отклонение отдельного результата; X±S_x — интервал среднего результата; Δx_отн (в %) —вероятная относительная погрешность.

Из литературных данных известно, что при определении ртути в биологических объектах по дитизонату производят предварительное выделение ее из минерализата или деструктата. Мы применили прямую экстракцию ртути из деструктата и определяли ее в виде дитизоната.

Получаемый по разработанной методике деструктат имеет примерно 2—4 н. концентрацию серной кислоты с небольшой примесью хлорной, кислотность его благоприятна для экстракции дитизоната ртути. Отсутствие активных окислителей в деструктате позволяет использовать экстракцию ртути в виде дитизоната для прямого ее определения.

Деструктаты всегда имеют желтую окраску за счет недоразрушен-ных пигментов тканей. Мы проверили экстрагируемость их хлороформом и четыреххлористым углеродом. Деструктаты получили разложением 20 и 50 г печени человека по описанной методике и подвергли экстракции 10 мл хлороформа или четыреххлористого углерода в течение 60 с.

Опыты показали, что четыреххлористый углерод не экстрагирует пигментов тканей, а хлороформ экстрагирует, окрашиваясь при этом в желтый цвет. Для полного удаления экстрагирующихся пигментов достаточно 2—3 экстракций хлороформом по 10 мл в течение 60 с. Предварительными опытами установлено, что из сернокислой среды ртуть хлороформом не экстрагируется.

Определение ртути в печени человека производили экстракцией ее в виде дитизоната как четыреххлористым углеродом, так и хлороформом. Печень предварительно проверяли на отсутствие ртути, накопленной в процессе жизнедеятельности организма.

К 20 г измельченной печени добавляли определенное количества ртути (2+). На следующий день производили деструкцию, как описано выше (в присутствии хлорной кислоты и без нее). Половину деструктата помещали в делительную воронку с усеченным конусом (30°) и производили экстракцию дитизоната ртути четыреххлористым углеродом, во второй половине деструктата экстрагировали его хлороформом.

При экстракции дитизоната ртути хлороформом деструктат предварительно встряхивали с 10 мл хлороформа в течение 10 с. Окрашенный в желтый цвет экстракт отбрасывали и повторяли экстракцию хлороформом до получения бесцветного экстракта. После этого производили экстракцию дитизоната ртути хлороформом, как описано выше.

Таблица 2

Определение ртути по дитизонату в 20 г печени (n=6)

Результаты опытов представлены в табл. 2.

Из табл. 2 видно, что ртуть в печени определяется при экстракции дитизоната ее четыреххлористым углеродом так же, как при экстракции хлороформом с точностью, удовлетворяющей задачи химико-токсикологической экспертизы.

При проведении деструкции по 2-му варианту без хлорной кислоты, были получены аналогичные результаты.

Прямое экстракционное определение ртути в печени в виде дитизоната дало возможность:

• а) сократить время отдельного определение ртути в 4—8 раз по сравнению с ранее предложенным осаждением на йодид меди;
• б) использовать для определения ртути более объективный инструментальный метод;
• в) сократить время деструкции в 2 раза (до 20—30 мин).

Поверочная реакция обнаружения ртути

Реакция образования однозамещенного дитизоната ртути в условиях исследования биологического материала специфична. Но при количествах ртути менее 0,005 мг окраска однозамещенного дитизоната ее в хлороформе и четыреххлористом углероде имеет желтовато-оранжевый цвет и может вызвать сомнение, так как продукты окисления дитизона при несоблюдении условий работы могут дать подобную окраску экстракта.

При сомнительной окраске экстракта дитизоната ртути мы предложили производить поверочную реакцию на ртуть с этим экстрактом. Дитизонат ртути реэкстрагировали в водную фазу и проделывали в ней реакцию на ртуть.

Экспериментальная проверка показала, что наилучшими реагентами для разложения дитизоната ртути являются: 0,25% раствор йода в 0,3% растворе йодида калия и 1,5% раствор тиосульфата натрия в 1 н. растворе соляной кислоты.

Для обнаружения ртути в полученных реэкстрактах была применена реакция образования тетрайодомеркуроата меди, так как проведению ее не мешает присутствие йодидов в указанной концентрации.

Методика исследования экстракта дитизоната ртути: экстракт встряхивали в делительной воронке в течение 60 с с 5 мл 0,25% раствора йода в 0,3% растворе йодида калия или с 5 мл 1,5% раствора тиосульфата натрия в 1 н. соляной кислоте. Реэкстракты отделяли от органической фазы, помещали в пробирку (при использовании тиосульфата натрия предварительно нейтрализовали кислоту), добавляли насыщенный раствор йода в 0,5% растворе йодида калия до уравнивания окраски с 0,25% раствором йода и 3 мл составного раствора (10% раствор сульфата меди, 2,5 н. раствор сульфита натрия и 8% раствор бикарбоната натрия в отношении 1:2:1,5) — в присутствии ртути появляется розовая окраска тетрайодомеркуроата меди.

Методика проверена на экстрактах дитизоната ртути, полученных при анализе 20 г печени. Результаты представлены в табл. 3.

Дополнительное использование в качестве поверочной реакции розовой окраски тетрайодомеркуроата меди позволяет сделать более надежным доказательство малых количеств ртути в органах человека. Затрата времени на проведение поверочной реакции в экстракте дитизоната ртути незначительна — до 5 мин.

Вывод

Разработан ускоренный метод определения ртути в органах человека в виде дитизоната. Граница определения 1•10^-3 мг в 20—50 г органа. Ошибка не превышает 8,2% при определении 0,01—2 мг в 20 г печени. Затрата времени — 60 мин.

Таблица 3

Результаты поверочной реакции тетрайодомеркуроата меди при анализе экстрактов дитизоната ртути

Обозначения: — отрицательный результат, от + до ++++ — положительный результат (розовая окраска различной интенсивности).

¹ Очистка дитизона и других реактивов описана в книге Г. Иванчева «Дитизон и его применение». М., 1961, с. 73—96.