Характеристика молекулярно-генетической индивидуализирующей системы на основе минисателлитного маркера D1S111

/ Ефремов И.А. Лебедева Н.Н. Земскова Е.Ю. Иванов П.Л.  // Мат. VI Всеросс. съезда судебных медиков. — М.-Тюмень, 2005.

Ефремов И.А., Лебедева Н.Н., Земскова Е.Ю., Иванов П.Л. Характеристика молекулярно-генетической индивидуализирующей системы на основе минисателлитного маркера D1S111

(Москва)

ссылка на эту страницу

Введение

Полиморфный минисателлит D1S111 впервые был выявлен с использованием мультилокусного зонда 33.6 в прицентромерной области длинного плеча хромосомы 1 [1-4]. Этот маркер расположен на 3'-конце гена CD3Z, кодирующего белок-предшественник зета-цепи Т3-антигена - поверхностного гликопротеина Т-лимфоцитов (TiT3 комплекс). Сам минисателлит D1S111 локализован в области 1q23, а содержащая его референтная последовательность AL359962, общей потяженностью более 67 т.п.н. локализована в области 1q23.3-q25.1.

В этом локусе было выявлено не менее 14 аллелей, содержащих от 9 до 22 повторов, с гетерозиготностью от 53 до 72%.

В 1996 году отечественными авторами была предложена праймерная система для амплификации аллелей этого маркера, определена нуклеотидная последовательность одного из аллелей, предложена номенклатура аллелей согласно числу тандемных повторов, а также изучено частотное распределение аллелей в выборке из русской популяции г. Москвы [5]. Это обусловило последующее использование минисателлита D1S111 в качестве молекулярно-генетической индивидуализирующей системы в судебно-медицинских приложениях по установлению родства и идентификации личности на территории России и ближнего зарубежья.

Тем не менее, уровень полиморфизма этого маркера до настоящего времени был охарактеризован недостаточно полно и на относительно малочисленных выборках. Кроме этого, в литературных данных имеются определенные неясности и разночтения, касающиеся структурной организации аллелей данного локуса. Изучение этих вопросов представляется актуальным с точки зрения повышения эффективности судебно-медицинских молекулярно-генетических идентификационных исследований с использованием этого маркера.

Предметом настоящего исследования явился сравнительный анализ референтных нуклеотидных последовательностей для локуса D1S111. Также была поставлена задача определения основных параметров полиморфизма этого локуса в репрезентативной выборке российского населения с целью практического использования в качестве индивидуализирующей молекулярно-генетической системы на территории России.

Результаты и обсуждение

На первом этапе работы мы провели сравнительный анализ четырех известных нуклеотидных последовательностей, ограниченных локализацией использованных нами праймеров [5] (Табл. 1).

Отметим, что нуклеотидная последовательность минисателлита D1S111 впервые была представлена в электронной базе данных GenBank в 1993 году, согласно опубликованным ранее данным [1]. На конец 2004 года в этой базе данных было представлено три референтные последовательности для минисателлита D1S111 (см. Табл. 1). Четвертая известная нуклеотидная последовательность, соответствующая аллельному варианту 14, описана ранее в работе [5].

По результатам проведенного анализа можно сделать вывод, что тандемный повтор D1S111имеет в среднем длину 37 п.н. и состоит, в свою очередь, из трех субповторов (Табл. 2). В некоторых случаях длина каждого из этих субповторов может отличаться на 1-2 п.н. от указанной величины из-за внутренних делеций или (реже) вставок.

Суммарно, сравнительный анализ референтных нуклеотидных последовательностей позволяет предположить следующую "усредненную" структуру для этого минисателлита:

Консервативная последовательность à [полный повтор, 37 п.н.]n à[субповторы 2 и 3] à[полный повтор с делецией одного основания в субповторе №3, 36 п.н.] à Консервативная последовательность.

Так, например, исходя из этой схемы, "усредненный" аллель 13 минисателлита D1S111 должен состоять из 12 полных (или почти полных) повторов, и еще одного повтора, в котором отсутствует субповтор 1. Действительно, именно такая структура соответствует показанному на Рис. 1. фрагменту длиной 531 п.н. референтной последовательности AL359962.

Соответственно, усредненный размер наиболее короткого обнаруженного нами аллеля 9, амплифицируемого с использованием указанных праймеров, должен составлять 383 п.н. Рассчитанные подобным образом размеры для всех известных аллелей приведены во втором столбце Таблицы 3. Указывая эти размеры с точностью до 1 п.н. мы учитываем, однако, возможность их отличия в пределах нескольких (1-3) пар нуклеотидов внутри каждой аллельной группы из-за возможных нуклеотидных вставок и делеций. Указанные размеры аллелей отличаются от данных, приведенных в работе [5] на 2 п.н. и, на наш взгляд, являются более точными.

Эти данные были нами использованы как опорные параметры для определения основных характеристик полиморфизма локуса D1S111 в репрезентативной выборке российского населения.

Всего было обследовано более 1000 человек из разных регионов Российской Федерации преимущественно русской национальности (по паспортным данным). По своему составу это была выборка русских с включенными мигрантами из других популяций, которую можно охарактеризовать как выборку из гетерогенной популяции. В ходе настоящего исследования общая обследованная выборка была разбита на две группы. Первая группа (далее по тексту - выборка 1) была составлена из числа фигурантов судебно-медицинских экспертиз, назначенных в Бюро судебно-медицинской экспертизы Департамента Здравоохранения г. Москвы в 1999-2003 годах (594 неродственных человека). Вторая группа (далее по тексту - выборка 2), объемом в 545 неродственных человек, была сформирована из числа фигурантов судебно-медицинских экспертиз, назначенных в Российский центр судебно-медицинской экспертизы Минздрава России в 2001-2004 годах.

В качестве биологического материала для анализа использовали образцы периферической крови обследуемых лиц.

Для амплификации аллелей локуса D1S111 использовали праймерную систему, описанную в работе [5]. Разделение продуктов полимеразной цепной реакции (ПЦР) осуществляли в 1,5-2% агарозных гелях с последующей окраской бромистым этидием.

Аллельные варианты локуса D1S111 идентифицировали по внешним стандартам молекулярных масс двумя разными методами.

Для выборки 1 в качестве стандарта прямого соответствия использовали искусственно синтезированную "псевдоаллельную лестницу", содержащую 17 негомологичных фрагментов ДНК длиной от 381 до 973 п.н., с шагом в 37 п.н. Эти фрагменты по размеру соответствуют аллелям 9 - 25 минисателлита D1S111.

Аллельные варианты локуса D1S111 для выборки 2 определяли другим методом: не непосредственным поиском прямого соответствия по размеру, а опосредованно, расчетным путем с помощью аппаратно-программной системы Kodak EDAS 120 (Кодак, США) с использованием в качестве маркера ДНК pBR322/AluI. Для вероятностно-статистического анализа данных были использованы компьютерные программы RXC (G. Carmody, Ottawa, Канада), Arlequin [6], и PowerStats [7].

На рис. 2 и 3 показаны репрезентативные результаты типирования ПДАФ ДНК локуса D1S111 двумя разными методами: с использованием "псевдоаллельной лестницы" для этого маркера и высокомолекулярного стандарта ДНК pBR322/AluI.

В табл. 4 представлено распределение наблюдавшихся генотипов в двух исследованных выборках. В каждой выборке было выявлено около 40% генотипов от общего числа возможных. При этом для обеих выборок наиболее частыми оказались три генотипа: гетерозиготы 15-18, а также гомозиготы 18-18 и 15-15.

Всего нами было выявлено 18 аллелей, содержащих от 9 до 26 повторов (см. табл. 3). Наиболее распространенными оказались аллели 15 и 18, частота наблюдений которых превысила 0,33 в выборке 1 и 0,28 в выборке 2. Примечательно, что в ходе настоящего исследования было выявлено 4 новых, то есть не описанных ранее, высокомолекулярных аллеля для этого маркера: это аллели с 23 (901 п.н.) по 26 (1012 п.н.). При этом аллель 26 наблюдался только один раз в гетерозиготном состоянии в выборке 1.

Значения основных популяционных характеристик локуса D1S111 для обеих исследованных выборок приведены в табл. 5. По этим данным, нформативность D1S111 для исследованной выборки превышает или сравнима с информативностью таких минисателлитов, как IL1RN-VNTR, RB1-VNTR, IgH-5'VNTR, D17S5, но уступает таким индивидуализирующим системам как D1S80 и ApoB-3'VNTR [5, 8-11].

Количественная оценка степени различий распределения аллелей и генотипов между двумя исследованными выборками, и по сравнению с другими данными, не являлась предметом настоящего исследования. Эта работа нами проводится и данные будут опубликованы отдельно.

Тем не менее, на качественном уровне отметим следующее.

Распределение аллелей в целом оказалось весьма сходным в обеих выборках, за исключением двух моментов. Во-первых, для самого распространенного в выборке 1 аллеля 18 частота наблюдений в выборке 2 оказалась существенно ниже (0,376 против 0,284). Во-вторых, аллель 19 в выборке 2 наблюдался в 3,8 раза чаще по сравнению с выборкой 1 (0,137 против 0,036). Кроме этого, что уровень полиморфизма для выборки 2 оказался существенно выше по сравнению с выборкой 1.

Наиболее вероятное объяснение этому заключается в том, что при электрофоретическом определении размеров амплифицированных фрагментов по нелокусному внешнему высокомолекулярному стандарту ДНК pBR322/AluI имеет место системная ошибка. При этом аллель 18 (716 п.н.) может ошибочно определяться как аллель 19 (753 п.н.).

Это объяснение выглядит достаточно убедительным в свете ранее полученных в работе [12] данных, касающихся изучения свойств гетерологичных маркерных систем применительно к фрагментному анализу ДНК, а именно, что определение размеров амплифицированных фрагментов по нелокусным внешним стандартам ДНК как в агарозных, так и в полиакриламидных гелях сложным образом зависит от экспериментальных условий и может быть некорректным в определенных диапазонах длин. Тем не менее прояснение этого вопроса требует отдельных исследований, которые нами сейчас проводятся.

Для проверки соответствия наблюдавшегося распределения генотипов локуса D1S111 в обеих исследованных выборках равновесию Харди-Вайнберга (РХВ) использовалось три различных статистических теста. Надо заметить, что в настоящее время для такого рода проверок используются различные статистические тесты. Однако выявление возможных (особенно – незначительных) отклонений весьма затруднительно при большом числе нулевых или уникальных классов наблюдений, что имеет место и в нашем случае. Для мини- и микро- сателлитных локусов в последнее время стандартной практикой является использование точных (вероятностных) тестов, и в первую очередь критерия Фишера, который в такой ситуации является наиболее мощным среди достоверных критериев [14, 15].

По результатам всех тестов, наблюдавшееся распределение генотипов только для исследованной выборки 1 не отклонялось от РХВ. Для выборки 2 наблюдались определенные отклонения, которые в настоящее время являются предметом дополнительных исследований. Возможно, что эти отклонения, так же как и отмеченный выше дисбаланс численных значений полиморфизма между выборками, обусловлены именно тем, что использованному при исследовании выборки 2 методу идентификации амплифицированных аллелей присуща определенная системная ошибка.

Результаты этих дополнительных исследований будут опубликованы отдельно.

Рис. 1 Фрагмент референтной нуклеотидной последовательности AL359962, ограниченной локализацией использованных праймеров (выделены в рамки). Отдельные повторы длиной 37 н.о., вынесены построчно.

 

1 2 3 М

Рис. 2. Электрофореграмма амплифицированных фрагментов ДНК (2,5% агорозный гель, окрашивание этидиумбромидом). Результаты типирования ПДАФ ДНК локуса D1S111 для выборки из 3 неродственных человек, в которой представлены 5 аллельных вариантов, в том числе достаточно редкий вариант 9 (показан стрелкой). M - аллельный маркер локуса D1S111, содержащий аллельные фрагменты с 9 (381 п.н.) до 25 (973 п.н.).

М 1 2 3

Рис. 3. Электрофореграмма амплифицированных фрагментов ДНК (2,5% агорозный гель, окрашивание этидиумбромидом). Результаты типирования ПДАФ ДНК локуса D1S111для выборки из 3 неродственных человек, в которой представлены 4 аллельных варианта. M – маркер молекулярных масс pBR322/AluI

 

Таблица 1

Референтные нуклеотидные последовательности для минисателлита D1S111

GenBank, номер доступа

Дата
публикации

Определение

Размер и тип последовательности

Размер ПЦР- фрагмента, п.н.

M30548

03-08-1993

Human minisatellite region detected by myoglobin 33-repeat probe, clone lambda 33.6.

548 п.н.
линейная ДНК

518

---

1996

Нуклеотидная последовательность аллеля №14 из работы [5]

566 п.н.
линейная ДНК

566

AK128376

19-02-2004

Homo sapiens cDNA FLJ46519 fis, clone THYMU3033649, highly similar to T-cell surface glycoprotein CD3 zeta chain precursor.

3008 п.н.
линейная кДНК

604

AL359962

22-11-2004

Human DNA sequence from clone RP11-104L21 on chromosome 1q23.3-25.1. Contains the 3' end of the POU2F1 gene for POU domain class 2 transcription factor 1, the 3' end of the CD3Z gene for CD3Z antigen zeta polypeptide (TiT3 complex) and two CpG islands, complete sequence.

67173 п.н.
линейная ДНК

531

 

Таблица 2

Структура усредненного тандемного повтора минисателлита D1S111

Субповтор

Длина, н.о.

Последовательность

1

12

tgg agg aag ggc

2

11

tgg agg agg gc

3

14

tcc gga gga agg gc

 

Tаблица 3

Распределение аллелей локуса D1S111 в двух исследованных выборках.

 

Аллель

 

Размер, п.н.

Выборка 1

Выборка 2

Число
наблюдений

Частота
аллеля

Число
наблюдений

Частота
аллеля

9

383

27

0,023

33

0,030

10

420

18

0,015

11

0,010

11

457

5

0,004

6

0,006

12

494

131

0,110

139

0,128

13

531

10

0,008

6

0,006

14

568

11

0,009

5

0,005

15

605

402

0,338

317

0,291

16

642

12

0,010

15

0,014

17

679

22

0,019

23

0,021

18

716

447

0,376

310

0,284

19

753

43

0,036

149

0,137

20

790

10

0,008

13

0,012

21

827

21

0,018

26

0,024

22

864

20

0,017

24

0,022

23

901

3

0,003

6

0,006

24

938

3

0,003

3

0,003

25

975

2

0,002

4

0,004

26

1012

1

0,001

0

0

Суммарно

1188

1,000

1090

1,003

 

Таблица 4

Распределение наблюдавшихся генотипов локуса D1S111 в двух исследованных популяционных выборках.

Под выделенной серым цветом диагональю таблицы приведено распределение генотипов для выборки 1, над диагональю - распределение генотипов для выборки 2.

Аллели

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

9

12

 

 

2

 

 

5

 

1

8

8

 

4

1

 

 

 

10

 

 

 

3

 

1

2

 

 

3

 

 

2

 

 

 

 

11

 

 

 

 

 

 

2

1

 

2

 

 

 

 

1

 

 

12

3

4

 

99

1

1

43

 

 

40

16

5

6

2

1

 

1

13

 

1

1

2

1�

 

1

 

 

2

2

 

 

 

 

 

 

14

1

 

 

1

 

1�

2

1

 

 

 

 

 

 

 

 

 

15

8

4

1

44

2

2

7952

1

10

88

38

4

6

7

1

2

1

16

 

 

 

 

 

 

2

 

1

1

5

1

1

2

1

 

 

17

2

1

 

4

 

 

4

 

 

7

3

 

 

 

1

 

 

18

7

4

3

43

2

4

144

8

10

9559

23

2

7

8

 

 

1

19

2

 

 

7

 

 

17

 

1

13

024

1

 

4

 

 

1

20

 

1

 

1

 

1

1

1

 

2

1

1�

 

 

 

 

 

21

2

1

 

 

 

 

6

1

 

7

2

 

 

 

 

 

 

22

 

2

 

3

 

 

7

 

 

6

 

 

1

 

 

 

 

23

 

 

 

 

 

 

1

 

 

1

 

 

 

1

 

1

 

24

 

 

 

1

 

 

 

 

 

1

 

 

1

 

 

 

 

25

 

 

 

 

 

 

1

 

 

1

 

 

 

 

 

 

 

26

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1

 

 

 

 

 

 

 

 

Таблица 5

Значения основных параметров прикладной информативности локуса D1S111 в двух исследованных выборках.

Оценочный параметр

Выборка 1

Выборка 2

Объем выборки, человек

594

545

Число выявленных аллелей

18 (9 – 26)

17 (9 – 25)

Число наблюдавшихся генотипов из общего числа возможных, (%)

66 из 171 (39%)

65 из 153 (42%)

Наблюдаемая гетерозиготность

0,685

0,732

Ожидаемая гетерозиготность (несмещенная оценка)

0,729 ± 0,008

0,797 ± 0,006

Вероятность случайного совпадения генотипов, pM

0,116

0,071

Дискриминирующий потенциал

0,884

0,929

Потенциал исключения отцовства

0,406

0,480

Усредненный индекс отцовства

1,59

1,87

Индекс полиморфизма

0,69

0,77

похожие материалы в каталогах

Генетические исследования

похожие статьи

О некоторых особенностях отбора трупных объектов для генетических исследований / Абдулина Е.В., Зыков В.В., Мальцев А.Е. // Вестник судебной медицины. — Новосибирск, 2018. — №4. — С. 50-54.

Возможность генетического исследования амниотической жидкости для установления отцовства в случае анэмбрионии / Зыков В.В., Абдулина Е.В., Мальцев А.Е. // Вестник судебной медицины. — Новосибирск, 2018. — №3. — С. 52-55.

Анализ генетических исследований абортивного материала / Абдулина Е.В., Зыков В.В., Мальцев А.Е. // Вестник судебной медицины. — Новосибирск, 2018. — №2. — С. 15-18.

Исследование аллельных вариантов полиморфных локусов Y-хромосомы в судебно-генетической экспертизе / Пурвэдулам Ш., Тэнуун Б., Гантуяа Б., Ганболд С. // Судебная медицина. — 2016. — №3. — С. 38-40.

Молекулярно-генетическое исследование плаценты и пуповины — случаи из практики / Кочеткова Е.А. // Судебная медицина. — 2016. — №1. — С. 45-47.