Использование методики окрашивания препаратов раствором акридинового оранжевого при определении групповой принадлежности изолированных клеток с помощью реакции смешанной агглютинации

При расследовании преступлений против личности одной из актуальных задач судебно-медицинской экспертизы является получение максимально возможной информации о природе объекта при исследовании его минимального количества [11]. Этого возможно достичь, используя в работе цитологические методики, которые позволяют, исследуя минимальное количество объекта, получить данные для его всесторонней характеристики [6].

При проведении судебно-медицинских экспертиз, связанных с половыми преступлениями, а также при исследовании «орудий, используемых для нанесения механической травмы человеку, нередко остаются различные следы наложения и среди них – частицы поврежденных тканей и органов человека. Эти частицы могут быть разными по размерам, но чаще они незначительны по величине (менее 1 мм), в связи с чем их относят к категории микрочастиц, т. е. к мелким телам, невидимым или слабо видимым при нормальных условиях наблюдения, т. е. без использования аппаратных средств» [4].

Исследование микрочастиц и изолированных клеток привело к освоению и внедрению практику новых модификаций методов цитологического исследования, что расширило доказательную значимость цитологических исследований при расследовании преступлений против личности.

Работа с клеточным материалом строится в соответствии с принятым алгоритмом. Изначально выполняются поисковые исследования. Затем, в случае обнаружения клеток и с учетом их морфологических признаков, производится дальнейшее их исследование с помощью применения специфических окрасок препаратов, выявляющих морфологические особенности клеток данного вида и их гистохимические свойства; при этом устанавливается органо-тканевая принадлежность клеток. Следующим этапом исследования клеток является исследование их на половую принадлежность, и завершающим этапом исследования клеток является определение их групповой принадлежности и последующая идентификация в отношении конкретной личности.

Для определения групповой принадлежности клеток используется реакция смешанной агглютинации.

Впервые антигенную дифференцировку органов и тканей человека с использованием метода специфической абсорбции антител применили в 1928 г., когда И.Л. Кричевский и Л.А. Шварцман, О.М. Земцова и А.А. Терехова, Е.М. Шварцман, K. Yosida, выявили антигены А и В в различных органах и тканях и установили полное соответствие между антигенами в тканях и группами крови по системе АВ0 [4]. А S. Yada (1961), S. Akaishi (1965), Н.Г. Шалаев (1965, 1966), Н.В. Еранов (1970), Л.А. Ревницкая с соавт. (1978) применили РСА в различных модификациях для выявления антигенов системы АВ0 в изолированных клетках печени, почки, легкого, головного мозга, сердца, матки, желудка, поджелудочной железы, эпидермиса, влагалищного и буккального эпителия [18–19, 12–13, 3, 7].

РСА состоит из двух этапов: на первом этапе происходит специфическое связывание антигенами клеточных мембран гомологичных антител, на втором – идентификация реакции антиген-антитело на клетках с помощью одноименных к использованию антителам эритроцитов» [11]. Для специфического связывания на первом этапе используются стандартные цоликлоны анти-А, анти-В и анти-Н в титре 1:256. Время абсорбции во влажных камерах 18 часов в условиях холодильника. Не связавшиеся антитела отмывают от свободных антител в 5 порциях охлажденного физраствора и высушивают. Проводится инкубирование с 0,25%-ной взвесью соответствующих тест-эритроцитов. Экспозиция во влажных камерах при комнатной температуре 2 часа. Далее препараты накрывают покровными стеклами и проводят микроскопический учет. Положительным результатом считают подвижное соединение эритроцитов как по краю клеток в виде розетки, так и на поверхности клеток.

В настоящее время разработано несколько модификаций этого метода:

• – постановка РСА без отмывания непрореагированнных антител, разработанный Т.В. Стегновой (1976) и модифицированный С.Ю. Силкиной (2008), для выявления антигенов АВ0 выделений [8–9].
• – использование сочетания реакции смешанной агглютинации и реакции иммунофлюоресценции для одномоментного выявления двух антигенов системы АВ0, разработанная Е.И. Королевой и Л.А. Тишиновой (1992) [5].
• – реакции смешанной агглютинации с использованием окраски препаратов раствором акридинового оранжевого для определения групповой принадлежности изолированных клеток с определенными морфологическими свойствами, разработанная А.Л. Федоровцевым, Л.А. Ревницкой и Е.И. Королевой (2009) [11].

В данной работе мы рассмотрим эффективность использования реакции смешанной агглютинации с использованием окраски препаратов раствором акридинового оранжевого. Особенно это актуально при проведении судебно-медицинских экспертиз, связанных с половыми преступлениями и при исследовании следов-наложений на орудиях травмы, особенно если по делу проходят несколько лиц.

Окраска флюорохромом акридинового оранжевого применяется для установления наличия клеток, их органо-тканевое происхождение, половая принадлежность клеток по X-хроматину и крови по полоспецифическим отросткам гранулоцитов. При этом флюорохром избирательно реагирует с нуклеиновыми кислотами (ДНК и РНК) клетки. Ядра клеток, содержащие ДНК, окрашиваются в зеленый цвет. Цитоплазма клеток, содержащих РНК, окрашивается в оранжево-красный цвет.

Техника постановки РСА с использованием окраски препаратов раствором акридинового оранжевого сводится к следующему:

• – в приготовленных препаратах с помощью соответствующих окрасок отыскивают клетки с интересующими эксперта морфологическими признаками и определяют их органо-тканевое происхождение;
• – проводят реакцию смешанной агглютинации, перед этапом инкубирования с 0,25%-ной взвесью соответствующих тест-эритроцитов препараты в течение 2 мин. окрашиваются 0,01%-ным р-ром акридинового оранжевого с последующим промыванием в течение 20–30 сек. физраствором.

Просмотр препаратов осуществляется в режиме люминесценции и в проходящем свете.

Наиболее эффективно использование данной методики при определении групповой принадлежности клеток влагалищного эпителия (в ядрах которых можно определить X-хроматин), а также в клетках органов и тканей, цитоплазма которых богата РНК и окрашивается акридиновым оранжевым в оранжево-красные тона (гепатоцитов, альвеолоцитов 1–2-го типов, нейронов головного мозга и т. д.) [11].

Приводим примеры применения высокочувствительной реакции смешанной агглютинации в модификации с использованием окраски препаратов раствором акридинового оранжевого.

Пример № 1. На судебно-медицинское исследование поступил смыв с полового члена гр-на О. По материалам следствия он совершил изнасилование гр-ки М. Проходящие по делу лица одногруппны по системе АВ0. При использовании реакции смешанной агглютинации с использованием окраски препаратов раствором акридинового оранжевого в просмотренных в режиме люминесцентной микроскопии на первом этапе были выявлены клетки влагалищного эпителия с содержащимся в них X-хроматином, а затем в режиме световой микроскопии определено наличие агглютинации с соответствующими тест-эритроцитами.

Таким образом, подтвердился факт наличия клеток влагалищного эпителия определенной групповой принадлежности в смыве с полового члена гр-на О.

Пример № 2. На судебно-медицинское исследование поступил нож, которым совершено убийство гр-ки М. и гр-на А. с повреждением органов грудной клетки (печени, легких, сердца). Проходящие по делу лица были одногруппны по системе АВ0. При использовании реакции смешанной агглютинации с использованием окраски препаратов раствором акридинового оранжевого в просмотренных в режиме люминесцентной микроскопии на первом этапе были выявлены клетки перикарда и альвеолоциты 1-го и 2-го типа с содержащимся в них X-хроматином, а затем в режиме световой микроскопии определено наличие агглютинации с соответствующими тест-эритроцитами. В данном случае удалось подтвердить факт нанесения телесных повреждений этим ножом именно гр-ке М.

Пример № 3. На судебно-медицинское исследование поступил смыв с полового члена гр-на Б. По материалам следствия он совершил изнасилование гр-ки Т. Проходящие по делу лица одногруппны по системе АВ0. При определении органо-тканевой принадлежности в смыве найдены клетки влагалищного эпителия. Групповую принадлежность устанавливали методом РСА с использованием препаратов раствором акридинового оранжевого. В выявленных клетках влагалищного эпителия обнаружен антиген иной групповой принадлежности, чем у предполагаемой потерпевшей Т. Таким образом, исключился факт присутствия клеток влагалищного эпителия потерпевшей Т. в смыве с полового члена гр-на Б.

Представленные примеры позволяют оценить значимость данной модификации РСА при работе с микроследами.

При анализе частоты использования данной методики в течение последних двух лет установлено, что она составляет 11% от всех проведенных экспертиз (из которых 60% составляют половые преступления, а 40% – связаны с исследованием следов-наложений на орудиях травмы). Такой небольшой процент, возможно, связан с появившейся у следователей возможностью исследования вещественных доказательств молекулярно-генетическим методом. Но в случае микроследов порой генетическая экспертиза, к сожалению, бывает бессильна. В то же время данный цитологический метод исследования позволяет дать достаточно исчерпывающую информацию о природе следов, что полностью удовлетворило бы потребности следственных органов и судов.

Заключение

Проведенными исследованиями проверена эффективность использования реакции смешанной агглютинации с использованием окраски препаратов раствором акридинового оранжевого при работе с микроследами (отдельными изолированными клетками). При этом определяется не только групповая принадлежность изолированных клеток, но и одномоментно их органо-тканевая и половая принадлежность по X-хроматину, а также половая принадлежность крови по полоспецифическим отросткам.

Список литературы

1. Барсегянц, Л.О., Кинле, А.Ф. Современное состояние судебно-медицинского исследования вещественных доказательств и пути развития // Перспективы развития и совершенствования судебно-медицинской науки и практики: материалы VI Всероссийского съезда судебных медиков. – Москва – Тюмень, 2005. – С. 43–45.
2. Вандер, М.Б. Понятие и значение микрочастиц в криминалистике // Правоведение. – 1978. – № 2. – С. 70–80.
3. Еранов, Н.В. К вопросу об определении групповой принадлежности животных клеток, выявляемых на орудиях механической травмы человека // Совр. вопр. судебн. медицины и эксп. практики. – Ижевск, 1970. – С. 67–70.
4. Загрядская, А.П., Федоровцев, А.Л., Королева Е.И. Судебно-медицинское исследование клеток и тканей. – М.: Медицина, 1984. – C. 35.
5. Королева, Е.И., Тишинова Л.А. Сочетание реакций смешанной агглютинации и иммунофлюоресценции для одновременного выявления двух антигенов системы АВ0 в изолированных клетках // Суд.-мед. эксперт. – 1992. – № 2. – С. 22–23.
6. Новоселов, В.П., Савченко, С.В., Целуева, Е.А. Судебно-медицинская диагностика клеток вагинального и буккального эпителия иммуноцитохимическим методом. – ГОУ ВПО Новосибирский государственный медицинский университет Росздрава. Межрегиональная ассоциация «Судебные медики Сибири», Наука, – 2009. – С. 4.
7. Ревнитская, Л.А., Колыш, М.Ш., Уточкина, Т.И. и др. О выявлении антигенов системы АВ0 в ороговевших эпителиальных клетках кожи // Вопр. суд-мед. экспертизы и криминалистики. – № 7. – Горький, 1978. – С. 66–69.
8. Силкина, Т.В. Комплексное исследование мочи в следах на вещественных доказательствах : автореф. дис. канд. … мед. наук. – М., 2008.
9. Стегнова, Т.В. Определение групп системы АВ0 в некоторых объектах биологического происхождения // Мат. I Всесоюзн. съезда судебных медиков. – Киев, 1976. – С. 487–488.
10. Томилин, В.В., Пашинян, Г.А. Руководство по судебной медицине. – М.: Медицина, 2001.
11. Федоровцев, А.Л., Ревницкая, Л.А., Королева, Е.И., Эделев, Н.С. Судебно-медицинские цитологические исследования следов на вещественных доказательствах. – Нижний Новгород, 2009. – С. 65–68.
12. Шалаев, Н.Г. Выявление агглютиногенов изосерологической системы АВ0 в отдельных эпителиальных клетках методами флюоресцирующих антител и смешанной агглютинации // Мат. 12 расширенной конф. Ленинградского отделения ВНОСМ. – Л., 1965. – С.16–18.
13. Шалаев, Н.Г. Судебно-медицинская экспертиза подозреваемых в половых преступлениях: автореф. дис. … д-ра мед. наук. – Горький, 1966.
14. Anderson T., Beans H.W. Cytological observation on the fane structure of the guinea pig ovary with special reference to the oogonium primar oocyte and associated follicle cells, J. Ultrastruct. Res., 3, 432 (1990).
15. Akaishi K. // Jap. J. Leg. Med. – 1973. – Vol. 27. – P. 356–367.
16. Coombs, R., Bedford, D., Rouillard L. A and B blood-group antigens of human epidermal sells demonstrated by mixed-agglutination // Lancet. 1956. Vol. 1. P. 461–463.
17. Hertig, A.T., Adams, E.S. Studies on the human oocyte and its follicle, J. Cell. Biol., 34, 647 (1997).
18. Yada, S. Mixed Agglutination on Smears // Jap. J. Leg. Med. 1961. Vol.15. P. 98–113.
19. Yosida, K. Uber Dai gruppenspecifischen Untershied der Transsudate, Exsudate, Sekrete, Exkrete, Organextrate und Organaellen des Men schen und ihre rechtsmedizinischen Anvendungen // Dtsch. Z. ges. Exp. Vtd. 1928. Bd 63. – P. 331–339.