Определение групповой принадлежности изолированных клеток влагалищного эпителия

Преступления против половой неприкосновенности и половой свободы личности являются одними из наиболее опасных и социально значимых, влекущие, как правило, применение наиболее жестких санкций за их совершение [3].

Поэтому резко возросший в последние годы уровень расследования подобных преступлений постоянно повышает требования к заключению как источнику доказательств по делу. В настоящее время одной из актуальных задач судебно-медицинской экспертизы является получение максимально возможной информации об объекте при исследовании ее минимального количества. Изучение таких объектов не в малой степени способствовало появлению нового направления в экспертизе объектов биологического происхождения – судебно-медицинских цитологических исследований [4]. Поэтому основными вопросами, решаемыми при проведении цитологических исследований в судебно-медицинской практике, являются определение органо-тканевой принадлежности изолированных клеток, установление их гистохимических свойств и определение групповой принадлежности. Органо-тканевую принадлежность изолированных клеток можно установить только при хорошо выраженных морфологических особенностях, соответствующих определенному органу, что наблюдается редко [5]. Для доказательства вагинального происхождения клеток Шалаев Н.Г. разработал комплексный метод, включающий изучение не только морфологических особенностей клеток, но и их цитохимических свойств с последующим определением групповой принадлежности [6].

Работами Дозорцевой Г.Л. (1920) показано, что в цитоплазме влагалищных клеток половозрелых женщин содержание гликогена во много раз выше, чем в клетках других органов и тканей [1]. Гликоген – главный резервный полисахарид высших животных и человека, построенный из остатков α-D-глюкозы, (C6H10O5)n. Открыт К. Бернаром в 1857 г. Содержится во всех органах и тканях животных и человека, в наибольшем количестве в печени (до 20%) и мышцах (до 4%). Гликоген дает цветную реакцию с йодом. При дифференциации влагалищных клеток от морфологически сходных с ним клеток уретрального и буккального эпителия было установлено, что в буккальных и уретральных клетках по сравнению с вагинальными гликоген встречается редко и в небольшом количестве (окраска цитоплазмы желто-коричневая). Поэтому наличие гликогена в цитоплазме является одним из важных критериев вагинального происхождения клеток. Исключение составляет влагалищный эпителий детей или женщин, находящихся в менопаузе, так как из-за выраженной эстрогенной недостаточности наблюдается отсутствие гликогена.

Для выявления гликогена в клетках влагалищного эпителия широкое распространение получила предложенная Н. Mack реакция с йодом, в результате которой гликоген, содержащийся в цитоплазме клеток, окрашивался в коричневый цвет (чем больше гликогена в цитоплазме, тем интенсивнее окраска) [2]. Для практического использования была предложена следующая методика: на препарат наносят каплю раствора Люголя (1 г кристаллического йода и 2 г йодистого калия растворяют в 10–20 мл дистиллированной воды и доводят объем до 300 мл дистиллированной воды), накрывают покровным стеклом и исследуют на любых микроскопах, имеющих собственный источник освещения и препаратоводитель. Окраска также используется для выявления гликогена, крахмала и йодофильной микрофлоры. Исследование препаратов начинают при малых увеличениях (с объективами 9–10×), что позволяет быстро оценить качество мазка и правильность его окраски. Объективы 20–40× могут использоваться для установления наличия клеток, диагностики их органо-тканевого происхождения, выявления гликогена, крахмала, элементов каловых масс и т. д. [4].

Следующим этапом исследования является установление органо-тканевой, половой и групповой принадлежности клеток влагалищного эпителия.

В настоящее время для определения групповой принадлежности в изолированных клетках предложены реакция смешанной агглютинации (РСА) и реакция иммунофлюоресценции (РИФ), что далеко не во всех случаях позволяет решить вопрос о наличии искомого антигена в конкретных клетках, интересующих эксперта (например, в смыве с полового члена, где вагинальные клетки находятся в смеси с уретральным эпителием и безъядерными эпидермальными чешуйками) Это связано с тем, что при постановке РСА используются неокрашенные мазки (а если они и были окрашены, то в процессе инкубации с сыворотками и последующих отмываний от непрореагированных антител происходит их обесцвечивание), в которых выделить по морфологическим особенностям конкретную клетку практически невозможно. При постановке РИФ также используются неокрашенные или контрастированные бычьим альбумином, меченым родамином препараты. Кроме того, при положительных результатах реакции наблюдается тотальное свечение клеточной мембраны, что маскирует морфологические особенности [4].

Поэтому Королевой Е.И. и Тишиновой Л.А. была разработана методика определения групповой принадлежности изолированных клеток с определенными морфологическими свойствами, с использованием методики окрашивания исследуемых мазков акридиновым оранжевым (АО). Окрашивание мазков раствором акридинового оранжевого позволяет найти в препаратах клетки с определенными морфологическими признаками, а также выявить в ядрах Х-хроматин. Поэтому использование данной методики наиболее эффективно при определении групповой принадлежности вагинальных клеток, а также в клетках органов и тканей, цитоплазма которых богата РНК и окрашивается АО в оранжево-красные тона. [4].

В работах Дозорцевой, М.Г. Арсеньевой и др. отмечаются морфологические признаки влагалищного эпителия (и его изменения на протяжении менструального цикла), а также его сходство с клетками буккального и уретрального эпителия [1]. Кроме того, при исследовании вещественных доказательств чаще встречаются клетки влагалищного эпителия поверхностного и промежуточного слоев с компактными ядрами, которые не всегда позволяют определить половую принадлежность (а использование 20-минутного гидролиза в 5н соляной кислоты для выявления Х-хроматина, независимо от концентрации АО, вызывает гомогенное окрашивание клеток в красно-оранжевый цвет и, следовательно, для цитохимического исследования непригодно).

В доступной литературе мы не обнаружили данных об использовании методики выявления гликогена в клетках влагалищного эпителия при определении их групповой принадлежности. В настоящее время имеются сведения о том, что выявление гликогена в цитоплазме является одним из важных диагностических признаков вагинального происхождения клеток. Учитывая вышеизложенное и актуальность вопроса, мы поставили цель: решить вопрос о возможности определения наличия в клетках гликогена (для идентификации клеток влагалищного эпителия) и выявления в них искомого антигена при проведении реакции смешанной агглютинации. Для решения поставленной задачи исследовали вещественные доказательства, предоставленные по половым преступлениям. При половых преступлениях изолированные клетки влагалищного эпителия могут быть выявлены на половых органах, в подногтевом содержимом подозреваемых, а также в пятнах на их одежде. Алгоритм исследования предполагает установление на вещественных доказательствах наличие клеток влагалищного эпителия, а затем их региональную, половую и групповую принадлежность. На первом этапе исследования необходимо определить в искомых клетках наличие гликогена (с помощью раствора Люголя или 0,01%-ным раствором родамина 6Ж), а затем с помощью соответствующих окрасок их органо-тканевое и половое происхождение.

Следующим этапом исследования является установление групповой принадлежности клеток. Для этого используется реакция смешанной агглютинации (РСА). Первые исследования по определению групповой принадлежности изолированных клеток начались еще с 1956 г., когда R. Coombs, D. Bedford, L. Rouillard применили реакцию смешанной агглютинации (РСА) для выявления антигенов А и В в клетках эпидермиса. РСА состоит из двух этапов: на первом этапе происходит специфическое связывание антигенами клеточных мембран гомологичных антител, а на втором – индикация реакции антиген-антитело на клетках с помощью одноименных к использованию антителами эритроцитов [7]. После первого этапа в результате инкубации с сыворотками и последующих отмываний от несвязавшихся антител происходит обесцвечивание препаратов, в которых определить по морфологическим особенностям конкретную клетку практически невозможно. В данной работе нами была предложена методика, позволяющая определить групповую принадлежность непосредственно в изолированных клетках влагалищного эпителия. Для этого после второго этапа РСА, когда уже произошло подвижное соединение соответствующих тест-эритроцитов с клетками (по краю клеток в виде розеток и на поверхности клеток), на препараты по каплям (2–3 капли) добавляют раствор Люголя, накрывают покровными стеклами. Препараты изучают в проходящем свете под микроскопом «МИКМЕД 1», объектив 10×, окуляр 10×. При этом происходит окрашивание цитоплазмы клеток влагалищного эпителия (за счет реакции с йодом гликоген окрашивается в коричневый цвет), что позволяет выявить искомый антиген непосредственно в найденной клетке. Свободно плавающие агглютинаты или прилипшие к предметному стеклу эритроциты не учитываются.

Приведем примеры практического использования предложенной методики.

Пример № 1. На судебно-цитологическое исследование поступили трусы и шорты подозреваемого гр-на Л. По следственным данным гр-ка О. была изнасилована гр-ном Л. Все проходящие по делу лица были одногруппны по системе АВ0 и относились к группе Вα. На представленных для исследования вещественных доказательствах (трусах и шортах гр-на Л.) были обнаружены клетки влагалищного эпителия, для определения групповой принадлежности которых была использована реакция смешанной агглютинации. В результате в исследуемых препаратах (с использованием методики выявления гликогена с помощью реакции с йодом) были найдены клетки влагалищного эпителия, цитоплазма которых окрасилась в коричневый цвет. На их поверхности было найдено подвижное соединение соответствующих тест-эритроцитов и выявлен антиген В, что не исключило их происхождения от гр-ки О.

Пример № 2. На судебно-цитологическое исследование поступили трусы подозреваемого гр-на П. По следственным данным, гр-ка Л. была изнасилована гр-ном П., и была попытка изнасилования несовершеннолетней гр-ки Р. У проходящих по делу лиц были следующие группы крови: 0(Н)αβ у гр-на П., Вα – у гр-ки Л. и Аβ – у гр-ки Р. На представленных для исследования вещественных доказательствах (трусах гр-на П.) были обнаружены клетки влагалищного эпителия, для определения групповой принадлежности которых была использована реакция смешанной агглютинации. В результате в исследуемых препаратах (с использованием методики выявления гликогена с помощью реакции с йодом) были найдены клетки влагалищного эпителия, цитоплазма которых окрасилась в коричневый цвет. На их поверхности было найдено подвижное соединение соответствующих тест-эритроцитов и выявлен антиген В, что не исключило их происхождения от гр-ки Л. Происхождение клеток влагалищного эпителии за счет несовершеннолетней гр-ки Р. исключилось.

Заключение

Таким образом, на основании проведенного исследования установлена эффективность использования реакции на гликоген для выявления клеток влагалищного эпителия при определении их групповой принадлежности в реакции смешанной агглютинации. Полагаем, что также необходимо использовать данную методику как альтернативную для определения групповой принадлежности клеток влагалищного эпителия с нечетко выраженными морфологическими особенностями (компактные и эксцентрично расположенные ядра, отсутствие в клетках завернутого края, неинтенсивная и равномерная окраска цитоплазмы и т.д.).

Список литературы

1. Дозорцева, Г.Л. Функциональная диагностика в акушерстве и гинекологии на основе цитологических исследований. – Минск, 1952. – С. 47–56.
2. Загрядская, А.П., Федоровцев, А.Л., Королева, Е.И., Судебно-медицинское исследование клеток и тканей. – М.: Медицина. – 1984. – С. 21.
3. Уголовный кодекс Российской Федерации : особенная часть : по состоянию на 14 марта 2017 г. – М.: Омега. – 2017. – C. 56.
4. Федоровцев, А.Л., Ревницкая, Л.А., Королева, Е.И., Эделев, Н.С. Судебно-медицинские цитологические исследования следов на вещественных доказательствах: Монография. – Нижний Новгород, 2009.
5. Загрядская А.П., Федоровцев А.Л., Королева Е.И., Судебно-медицинское исследование клеток и тканей. – М.: Медицина. – 1984. – С. 7.
6. Шалаев, Н.Г. Судебно-медицинская экспертиза подозреваемых в половых преступлениях: Автореф. дис. … д-ра мед. наук. – Горький, 1966.
7. Coombs R., Bedford D., Rouillard L. A and B blood-group antigens of human epidermal sells demonstrated by mixed-agglutination // Lancet. – 1956. – Vol. 1. – P. 461–463.